用于治疗神经退行性疾病的干细胞衍生多巴胺能细胞的生产方法和组合物技术

本发明专利技术涉及生产多巴胺能细胞和评价其功能的方法。在包被有层粘连蛋白‑111、层粘连蛋白‑121、层粘连蛋白‑521、层粘连蛋白‑421或层粘连蛋白‑511的培养板上，使用含有GSK3抑制剂和TGF‑β抑制剂并适时施加成纤维细胞生长因子的培养基来培养多能人胚胎干细胞，此时所需神经细胞以更高的速率产生。本发明专利技术还描述了用于生产这种多巴胺能细胞的有用的细胞培养试剂盒，以及使用这种细胞进行干细胞治疗的方法。

Production methods and compositions of stem cell derived dopaminergic cells for the treatment of neurodegenerative diseases

The present invention relates to a method for producing dopaminergic cells and evaluating their functions. In coated with laminin 111, laminin 121, laminin 521, laminin 421 or laminin 511 culture plate, containing GSK3 inhibitors and TGF inhibitors and beta timely applied medium to develop pluripotent human embryonic stem cells fibroblast growth factor the time required to produce neural cells at a higher rate. The invention also describes a useful cell culture kit for producing this dopaminergic cell, and a method for stem cell therapy using this cell.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于治疗神经退行性疾病的干细胞衍生多巴胺能细胞的生产方法和组合物相关的申请的交叉引用本申请要求于2015年2月25日递交的美国临时专利申请号62/300,000、2015年6月19日递交的美国临时专利申请号62/182,051以及2015年4月9日递交的美国临时专利申请号62/145,467的优先权，通过引用将前述申请的全部公开内容并入本文。
技术介绍
通过引用将文件名为“Seq_List_LCTI_200040USP3_ST25.txt”的ASCII文本文件中的材料并入本申请，该文件创建于2006年2月10日，文件大小为8,781字节。本专利技术涉及由人类多能干细胞(hESCs)生产某些所需的多巴胺能细胞的方法，以及基于分子标志物预测其移植至脑部后的表型成熟的方法。这些多巴胺能细胞可用于基于干细胞的治疗，例如治疗包括帕金森病在内的神经退行性疾病。本专利技术还公开了用于实施该方法的试剂盒。通常，在层粘连蛋白-111(或其他重组生产的层粘连蛋白)的基底上培养干细胞，并将这些干细胞暴露于多种细胞培养基中，以便比此前方法更高效地获得多巴胺能细胞。层粘连蛋白是主要存在于基膜的异三聚体糖蛋白家族。它们通过与一侧相邻细胞受体结合相互作用，以及与其他层粘连蛋白分子或其他基质蛋白(例如胶原、巢蛋白或蛋白聚糖)结合来起作用。层粘连蛋白分子也是重要的信号转导分子，可以强烈影响细胞的行为和功能。层粘连蛋白在维持细胞/组织表型方面，以及在组织修复和发育中促进细胞生长和分化方面都很重要。层粘连蛋白是一类多结构域的大蛋白，具有共同的结构组织。层粘连蛋白分子包括一个α链亚基、一个β链亚基和一个γ链亚基，它们通过一个卷曲螺旋结构域连接形成三聚体。在天然组织中，十二种已知的层粘连蛋白亚基链可以形成至少15种类型的三聚体层粘连蛋白。在三聚体层粘连蛋白结构内具有与其他层粘连蛋白和基膜分子结合活性的可识别结构域以及膜结合受体。图1分别示出了三种层粘连蛋白链亚基。例如，结构域VI、IVb和IVa形成球状结构，而结构域V、IIIb和IlIa(其含有富含半胱氨酸的EGF样元件)形成棒状结构。三条链中的I和II结构域参与形成三股铰链卷曲螺旋结构(长臂)。在人组织中存在五种不同α链、三种β链和三种γ链，已经发现了至少十五种它们的不同组合。基于它们的历史发现顺序，这些分子被命名为层粘连蛋白-1至层粘连蛋白-15，而另一种命名法依据其链的组成描述了其异构体，例如包含α-1、β-1和γ-1链的层粘连蛋白-111(层粘连蛋白-1)。已经确定出四个由结构定义的层粘连蛋白家族组。五个已确定的层粘连蛋白分子构成第一组，它们的β1和γ1链相同，而α链组成不同(α1至α5链)。包括层粘连蛋白-521在内的五个已确定的层粘连蛋白分子构成第二组，它们的β1和γ1链相同，而α链组成不同。已确定的层粘连蛋白分子的第三组只有一个已确定的成员，层粘连蛋白-332，其链组成为α3β3γ2。已确定的层粘连蛋白分子的第四组只有一个已确定的成员，层粘连蛋白-213，其具有新识别出的γ3链(α2β1γ3)。人类胚胎干细胞(hES)为多种疾病的再生医学发展提供了希望，所述疾病如脊髓和心脏损伤、I型糖尿病和诸如帕金森病之类的神经退行性疾病等。干细胞是一种未分化的细胞，其可分化成为特化的细胞。胚胎干细胞具有广泛的自我更新能力和多能性，具有分化成所有三种胚层的细胞的潜力，其可用于治疗目的，并且可以为组织替代疗法、药物筛选、功能基因组学和蛋白质组学提供无限的细胞来源。干细胞疗法和对神经退行性疾病的治疗有望很快进入临床试验。然而，在制定标准化优良制造标准(goodmanufacturingpractices,GMP)级的人多能干细胞(hPS)的祖细胞时，仍然存在一个主要障碍——这些祖细胞移植后会在成年人大脑中成熟并发挥功能。由于细胞移植时是未成熟的祖细胞，并且其在体内完全成熟成为功能集成的神经元需要6个月或更长时间，因而在移植前无法对所移植细胞的功能性进行评估，并且也缺乏对未成熟祖细胞的产量和成熟度进行预测的可靠标志物。作为预测功能性标志物的替代物，本领域依赖于对移植的祖细胞进行评估，所述评估是通过与产生某些神经元亚型相关的基因和蛋白质的表达来进行的。由于不确定这些标志物能否预测终末分化和功能成熟，因此祖细胞必须通过长时间的体内功能评估，以便控制批次间的变异和治疗效果。这对为更大群体的患者生产细胞以及推出标准化的临床用干细胞产品造成了重要的阻碍。为了减少必须在细胞发育过程中进行的体内研究，有必要确定一组有效的标志物，这些标志物可以在移植前预测干细胞产物的体内表现。在祖细胞阶段就能够预测体内移植的结果，也使得能够生产不同来源的标准化细胞产物，例如源自患者衍生细胞或患有HLA-单倍型供体的hPS细胞库。由于特定类型的中脑多巴胺能(mesencephalicdopamine,mesDA)神经元的相对局灶性退变，帕金森病是干细胞疗法特别感兴趣的靶标。在许多使用胎儿细胞的临床试验中，已经从概念上证实了帕金森病细胞替代疗法是可以成功的。近来的研究发展使我们能更好地理解来自中脑腹侧神经底板的mesDA神经元的发育和细胞个体发生学，并且这些知识已经使由hPS细胞形成腹侧中脑祖细胞的研究级实验方案得以具体化。与旧有方案相比，已证实这些腹侧中脑衍生的多巴胺能神经元能够在帕金森病的动物模型中存活、成熟并获得适当的功能特性。此外，由这些实验方案产生的移植物不会导致细胞过度生长或肿瘤形成，因而其可作为合适的干细胞替代疗法的候选细胞。在目前的腹侧中脑分化实验方案中，移植前通常在体外用中脑神经底板标志物LMX1A、FOXA2、OTX2和CORIN来确认祖细胞的mesDA同一性，但是一项新的研究显示：这些标志物和其他几种常用的腹侧中脑标标志物也在下丘脑核的间质祖细胞中共表达。因此，在生产富集的mesDA神经元的实验方案中它们似乎并非最优的标志物，因为显然它们对mesDA结构域并无特异性。为再生医学和人类神经细胞建模的目的，需要在化学限定的、无异种的、无病原体的条件下发展多能干细胞衍生和培养方法，以将这些细胞重新分化为具有再生能力的神经细胞。期望的是这样的方法应该能提供大量的这种分化的细胞。此外，发展预测移植的祖细胞在动物模型中的成功移植结果的方法也是期望的。
技术实现思路
本专利技术提供了生产某些特定干细胞衍生所需的多巴胺能细胞的方法，以及在移植后评价其功能的方法。这些多巴胺能细胞可用于基于干细胞的治疗，例如治疗包括帕金森病在内的神经退行性疾病。在其他方面中，本专利技术提供了用于由胚胎干细胞生产多巴胺能细胞的试剂盒。本专利技术还提供了某些所需干细胞的单层培养方法，这种方法增加了细胞的同种性，从细胞培养板或单细胞悬浮液中的其他细胞支持物中去除干细胞，在用于传代的单细胞悬浮液中将干细胞重新铺板接种并且在使得干细胞培养物能够扩增并大量生产这种细胞的大量稀释液中进行扩增。在一些方面中，本专利技术描述了多潜能干细胞在层粘连蛋白-111或层粘连蛋白-121基底上的铺板接种，并使用几种不同的细胞培养基来培养细胞，以获得多巴胺能细胞，特别是尾部化的多巴胺能祖细胞。铺板接种前可以用EDTA对细胞进行传代。在各种实施方案中，可以使用多达六种不同的细胞培养基。在其他实施方案本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有高概率成功移植结果的用于提供尾部多巴胺能祖细胞的方法，其包括：将胚胎干细胞铺板接种于包被有层粘连蛋白‑111、层粘连蛋白‑121、层粘连蛋白‑521、层粘连蛋白‑421或层粘连蛋白‑511的第一基底上以获得多巴胺能祖细胞；鉴定表达尾部腹侧中脑标志物的多巴胺能祖细胞；以及从基底上的其他多巴胺能祖细胞中分离经鉴定的多巴胺能祖细胞，以获得具有高概率成功移植结果的尾部多巴胺能祖细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.04.09 US 62/145,467;2015.06.19 US 62/182,051;1.一种具有高概率成功移植结果的用于提供尾部多巴胺能祖细胞的方法，其包括：将胚胎干细胞铺板接种于包被有层粘连蛋白-111、层粘连蛋白-121、层粘连蛋白-521、层粘连蛋白-421或层粘连蛋白-511的第一基底上以获得多巴胺能祖细胞；鉴定表达尾部腹侧中脑标志物的多巴胺能祖细胞；以及从基底上的其他多巴胺能祖细胞中分离经鉴定的多巴胺能祖细胞，以获得具有高概率成功移植结果的尾部多巴胺能祖细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括将尾部多巴胺能祖细胞移植到哺乳动物患者的脑中。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述哺乳动物患者是人。4.根据权利要求2所述的方法，其中所述移植可用于治疗神经退行性疾病，例如帕金森氏病。5.根据权利要求1所述的方法，其中多巴胺能祖细胞的鉴定步骤是通过鉴定表达高水平EN1、SPRY1、WNT1、CNPY1、PAX8、ETV5、PAX5、FGF8、SP5或TLE4的细胞来进行的。6.根据权利要求1所述的方法，其中多巴胺能祖细胞的鉴定步骤是通过鉴定表达高水平EN1、SPRY1、PAX8、CNPY1和ETV5的细胞来进行的。7.根据权利要求1所述的方法，其中多巴胺能祖细胞的鉴定步骤进一步包括排除表达高水平EPHA3、FEZF1或WNT7B的细胞。8.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括鉴定和排除表达高水平BARHL1、BARHL2、FOXG1、SIX3、HOXA2、GBX2或PAX6的多巴胺能祖细胞。9.一种诱导产生尾部腹侧中脑祖细胞的方法，其包括：将胚胎干细胞铺板接种于含有层粘连蛋白-111、层粘连蛋白-421、层粘连蛋白-511或层粘连蛋白-521的基底上，以产生尾部腹侧中脑祖细胞。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述干细胞在含有N2培养基、TGF-β抑制剂、头蛋白、声猬蛋白和GSK3抑制剂并且不含B27补充剂的初级培养基中进行培养。11.根据权利要求10所述的方法，其中去除所述初级培养基并加入二级培养基，所述二级培养基含有N2培养基和成纤维细胞生长因子(FGF)，不含B27补充剂。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述FGF是FGF8b。13.根据权利要求11所述的方法，其中所述二级培养基在铺板接种后约156小时至约228小时内加入。14.根据权利要求11所述的方法，其中除去所述二级培养基，并重新铺板接种干细胞。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述重新铺板接种在铺板接种后约252小时至约276小时内进行。16.根据权利要求14所述的方法，其中所述重新铺板接种使用含有B27培养基、ROCK抑制剂、FGF、脑源性神经营养因子(BDNF)和抗坏血酸的三级培养基进行。17.根据权利要求14所述的方法，其中所述干细胞使用四级培养基来培养，所述四级培养基含有B27培养基、FGF、脑源性神经营养因子(BDNF)和抗坏血酸。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述干细胞在铺板接种后约324小时至约396小时内使用四级培养基培养。19.根据权利要求17所述的方法，其中所述干细胞在约108小时至约132小时的时间段内用四级培养基培养。20.一种诱导产生多巴胺能干细胞的方法，其包括：将多能干细胞铺板接种于包被有层粘连蛋白-111、层粘连蛋白-121、层粘连蛋白-521、层粘连蛋白-421或层粘连蛋白-511的基底上以获得多巴胺能细胞。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述细胞在铺板接种前用EDTA进行传代。22.根据权利要求20所述的方法，其中所述细胞在第一培养基中培养，所述第...

【专利技术属性】
技术研发人员：阿格尼特·柯克比，马林·佩尔尼莱·帕马，
申请(专利权)人：拜奥拉米那公司，
类型：发明
国别省市：瑞典,SE