包含神经干细胞、EGF和FGF‑2的组合物制造技术

本发明专利技术关于一种包含神经干细胞、EGF和FGF‑2的组合物，其特征在于，所述神经干细胞是贴壁单层培养物，组合物中至少80%的细胞是对称分裂的神经干细胞且不多于1%的细胞表达成熟的星形细胞、神经元或少突胶质细胞的标记物，所述神经干细胞不是来自人胚胎干细胞。本发明专利技术的制备方法简单，便于操作。

The composition contains neural stem cells, EGF and FGF 2

The invention relates to a composition containing neural stem cells, EGF and FGF 2, which is characterized in that the neural stem cells are adherent monolayer culture, at least 80% cells in the composition is a marker of neural stem cells expressed symmetrically and not more than 1% of the cells mature astrocytes, neurons or less oligodendrocytes, the neural stem cells from human embryonic stem cells is not. The preparation method of the invention is simple and easy to operate.

【技术实现步骤摘要】
包含神经干细胞、EGF和FGF-2的组合物
本专利技术涉及神经干细胞以及培养神经干细胞培养条件和方法，特别提供了包含神经干细胞、EGF和FGF-2的组合物。
技术介绍
虽然据说神经干细胞可在体外分离自多种来源，但迄今仍不可能在对称分裂、未分化状态的大规模培养中扩展细胞。从实验和治疗观点来看，都非常需要使在此状态中长期扩展细胞。获得的纯神经干细胞群体能够定向分化为三种细胞类型：神经元、星形细胞和少突胶质细胞。培养神经干细胞（虽然作为不均一细胞群体的一小部分）的一种已知方法是神经球(neurosphere)系统。此系统包括连续传代不均一的细胞聚集体，其中仅有一小部分是真正的神经干细胞。神经球中的大多数细胞是定型祖细胞。有许多关于神经球的不均一性和不稳定性，以及它们产生神经元的能力有限的报道(如Morshead等，2002)。Rappa等，Neuroscience2003报道了以下方法：将神经球细胞平板接种在纤连蛋白上1-7天以转染神经球细胞，然后重建神经球但不提供神经球内干细胞（如果有）的显著表征。Suslov等，2002提供了明确数据证明，神经球系统太不均一，以致于不能有意义地表征其中的任何干细胞。主要结论是，神经球内不仅不均一一”显示克隆内神经细胞谱系多样性，即除NSC以外，它们含有不同分化状态的神经元祖细胞和神经胶质祖细胞”一而且不同克隆神经球品系之间的基因表达型存在很大差异。正如论文中明确确认的那样，Suslov的基因表达型分析没有建立神经球内干细胞的定义：一“获得的分子表型表明我们系统中的产克隆NSC是不均一的，其中的亚组反映出不同的神经发育定型”。本领域的许多文献描述了胶质细胞的特性。Skogh等，MCN2001描述了表达GFAP以及对RC2和干蛋白染色易变的胶质细胞培养物一应注意，在体内，放射状胶质中不表达小鼠GFAP(Rakic，2003)。他们报道，他们的细胞不表达神经原性放射状胶质的标记Pax6(Malatesta等，2001，2003)，他们没有检测到其它放射状胶质标记。他们有不均一的培养物，没有进行克隆分析。关于体外放射状胶质的其它报道认为它们是分化中间体或最终产物。因此，Bibel等(NatNeurosci，2004)报道了从ES绌胞通过瞬时放射状胶质样细胞产生神经元，Gregg和Weiss(JNeurosci，23：11587-601，2003；美国专利公开2003/0032181)描述了神经球细胞”分化”为放射状胶质。Hartfuss等(DevBiol，2001)证明，放射状胶质存在于神经球。Gregg和Weiss发现，放射状胶质是神经球的分化产物，可以断定“这些结果表明神经干细胞可产生RGC[放射状胶质细胞]和成年动物CNS中可重演(recapitulate)RGC指导的迁移”。流行的观点是：放射状胶质是神经球产生的分化细胞类型之一。Liour和Yu(Glia，2003)证明，放射状胶质细胞分化可获自ES细胞，但本领域的其它报道没有提到神经原性放射状胶质的扩展。Gobbel等，BrainRes2003报道了多能大鼠细胞能增殖为“松散地粘附于基材上生长的细胞的球状簇”，即不形成均一的单层。而且，此论文的摘要断定：“这些细胞在3次分裂中大约两次产生有丝分裂后细胞，因此使扩展困难”。他们的培养物中广泛出现产胶质细胞的分化，但作者发现“相对少”(<3%)神经元。他们没有提供细胞的分子表型。W001/30981描述了可分化为神经元的细胞的培养物。但这些细胞是GFAP和干蛋白阳性，被描述为星形胶质细胞，是相对不纯的混合群体。干细胞需要特定细胞微环境或小生境的观点是干细胞生物学中的正统观点。虽然不总是承认，但已知神经球干细胞仅构成祖细胞、母细胞和未成熟的分化后代等全部细中的一小部分。此种混合细胞类型的聚集可构成其中可能有干细胞的小部分细胞的小生境。文献中没有报道过由ES细胞产生神经干细胞的均一群体，仅产生可能在变为胶质细胞限制性之前瞬时扩展的神经上皮前体细胞(如Brustle等，Sclence1999)。因此，本领域中存在许多问题。所有报道都承认他们的培养物是不均一的。不可能用神经球系统维持对称分裂和不分化状态的神经干细胞的大规模培养。培养大量神经干细胞的其它尝试没有成功地超过5-20代，细胞高度倾向于分化乜阻碍了这些尝试。例外是有关成年大鼠海马干细胞的工作，但这些是染色体组型异常，并且低效率地形成神经元。当瞬时神经发育前体己知时，没有分离和纯化到永生或接近永生的自我更新干细胞。需要由ES细胞产生神经干细胞，然后在纯培养物中维持这些神经干细胞，但迄今这还不可能。也需要由ES细胞产生神经干细胞用于移植，但已知ES产生的细胞群体中持续存在ES和其它非神经细胞会在受试动物中产生肿瘤。还需要由胚胎和出生后的CNS获得纯神经干细胞群体。完全理解控制神经干细胞行为的分子和细胞事件是必要的，它不仅是理解胚胎发生的途径，而且是可分离、扩展和控制神经干细胞用于将来的治疗应用的框架。本领域已知的神经干细胞的培养方法（由于上述原因）不适合用于这些研究和治疗应用。因此，需要开发培养能将细胞维持在对称分裂自我更新状态中的大量神经干细胞的方法和条件。尤其需要有确定成分培养基，它应满足上述要求，因为临床上非常需要采用确定成分培养基。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种包含神经干细胞、EGF和FGF-2的组合物。本明所述包含神经干细胞、EGF和FGF-2的组合物，其特征在于，所述神经干细胞是贴壁单层培养物，组合物中至少80%的细胞是对称分裂的神经干细胞且不多于1%的细胞表达成熟的星形细胞、神经元或少突胶质细胞的标记物，所述神经干细胞不是来自人胚胎干细胞。专利技术优点是：提供了一种更加稳定的包含神经干细胞、EGF和FGF-2的组合物，通过原代神经干细胞悬浮培养，达到纯化细胞的目的，之后加入血清进行细胞贴壁培养，极大的加强了神经干细胞的活性，提高了神经干细胞的增殖速度。使神经干细胞的培养更加的稳定，更容易建成相应的神经干细胞系，可以收获大量的神经干细胞而不会出现像传统培养方法那样因没有足够的神经干细胞而不能进行相关科研工作的尴尬情况，培养过程中可以更加直观的观察细胞动态，可以做一些悬浮细胞无法进行的鉴定工作，并且本专利技术的制备方法更加简单，便于操作，节省了大量的工作时间，方法简单，操作容易，非常适合科研工作的使用，节省了科研工作人员大量的时间和精力。具体实施方式下面通过具体的实施例对本专利技术做进一步的详细描迷。本专利技术实施例所采用的，包括神经组织保存液、神经组织洗涤液、神经组织分解液、细胞洗涤液、原代细胞培养液、细胞消化液、继代细胞培养液、细胞冻存液等，其中，继代细胞培养液为神经干细胞的含血清生长培养基，该培养基由lOOOml的基础培养基、50ug/ml的胎牛血清、lOng／ml的bFGF、lOng／ml的EGF、0.5mmol/ml的谷氨酰胺、0.5mmol/ml的丙酮酸钠混合组成。继代细胞培养液为获得的神经干细胞贴壁培养液，使神经干细胞得以贴壁培养，具有更强的活性。所述的神经组织保存液为含有链霉素50ug/ml、青霉素50ug／ml的RPMI-1640、DMEM、a-MEM、DMEM/F12中的一种或两种以上混合本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包含神经干细胞、EGF和FGF‑2的组合物，其特征在于，所述神经干细胞是贴壁单层培养物，组合物中至少80%的细胞是对称分裂的神经干细胞且不多于1%的细胞表达成熟的星形细胞、神经元或少突胶质细胞的标记物，所述神经干细胞不是来自人胚胎干细胞。

【技术特征摘要】
1.一种包含神经干细胞、EGF和FGF-2的组合物，其特征在于，所述神经干细胞是贴壁单层培养物，组合物中至少80%的细胞是对称分裂的神经干细胞且不多于1%的细胞表达成熟的星形细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：王振宇，
申请(专利权)人：温州市鹿城区中津先进科技研究院，
类型：发明
国别省市：浙江,33