本发明专利技术提供了一种Hemi‑M甲基化修饰引物及其应用，所述引物至少含有一个被甲基化修饰的胞嘧啶，其中，所述甲基化修饰包括甲基化和/或羟甲基化修饰；本发明专利技术通过设计特异性的甲基化修饰引物，巧妙地与dCTP被mdCTP替代的dNTP相结合，对样本DNA进行胞嘧啶保护，创造性地将其应用于甲基化文库的构建，辅佐以特定的标签，适用于多种应用领域和场景，从而解决文库DNA自身对比分析的问题，实现更准确的甲基化位点分析，具备广阔的应用前景和巨大的市场价值。
A Hemi-M methylation modified primer and its application
The present invention provides a hemi_M methylation modified primer and its application, which contains at least one methylated cytosine, in which the methylation modification includes methylation and/or hydroxymethylation modification; The invention ingeniously replaces dNTP with dCTP by mdCTP by designing specific methylation modified primers. Combining with cytosine protection of sample DNA, creatively applying it to the construction of methylated library, assisted by specific tags, it can be applied to various application fields and scenarios, thus solving the problem of comparative analysis of Library DNA itself and realizing more accurate methylation site analysis, which has broad application prospects and huge potential. Market value.
【技术实现步骤摘要】
一种Hemi-M甲基化修饰引物及其应用
本专利技术涉及分子生物学
，尤其涉及一种Hemi-M甲基化修饰引物及其应用。
技术介绍
在表观遗传学中，甲基化是目前研究中相对较为深刻的。DNA的甲基化水平可以决定一个或者一类基因的表达或者抑制，对于细胞功能正常与否有着重要作用，进而影响人类的生命进程。所以，甲基化研究是表观遗传学研究的热门领域之一。基因组DNA水平的甲基化是在DNA甲基转移酶的作用下，以硫腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，将一个甲基添加到胞嘧啶5’-碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶，原理如图1所示。CpG岛(CpGisland)是富含CpG二核苷酸的一些区域，长度为300—3000bp，CpG是胞嘧啶(C)—磷酸(p)—鸟嘌呤(G)的缩写，位于转录起始位点上游的启动子区域，看家基因的启动子CpG岛保持非甲基化状态，以保证看家基因的正常表达。组织特异性基因的CpG相对较少，并且在大多数组织中都处于甲基化状态。当启动子区域的CpG被甲基化时，转录受到抑制，该区域的CpG甲基化密度与转录抑制的程度有关。肿瘤组织中存在着基因组普遍低甲基化和局部区域过甲基化。抑癌基因启动子区域CpG岛过甲基化是许多肿瘤发生的早期重要事件，抑癌基因启动子区域CpG岛过甲基化可致使相关基因表达下调，甚至不表达，从而影响细胞内及细胞间正常生长凋亡。原癌基因的低甲基化，可以引起原癌基因的转录激活，同时也能影响临近基因的正常表达。DNA的去甲基化破坏基因组印记，增加了患癌风险。目前的甲基化研究方法中，主要包含：甲基化特异性PCR、重亚硫酸盐测序法、高分辨率溶解曲线法、基因组直接测序法等。最常用的方法是重亚硫酸盐的方法。该方法中，在重亚硫酸盐的作用下，DNA中未被甲基化修饰的胞嘧啶(C)转化为尿嘧啶(U)，通过高通量测序检测出未被转化的胞嘧啶(C)，即为被甲基化修饰。CN105002567A提供了一种无参考基因组高通量简化甲基化测序文库的构建方法，对样品基因组酶切和加A，获得5’末端具有磷酸化修饰和3’粘性末端A的DNA片段，将其与含有不同条形码序列的甲基化接头相连；连接产物分为两组，一组进行PCR扩增，另一组经重亚硫酸盐转化后再扩增，获得两组含有相同条形码、仅在无甲基化的胞嘧啶位点不同的扩增产物序列；两组PCR产物分别混合，选择相同的特定长度片段序列进行低循环PCR，扩增产物分别分离纯化构建高通量简化甲基化测序文库。该方法通量高、成本低、序列一致，无需参考基因组，在大量无参考基因组或参考基因组组装不全物种的DNA甲基化表观遗传学研究领域应用前景广阔。CN104532360A提供了一种全基因组甲基化测序文库及其构建方法。该构建方法包括以下步骤：S1，对全基因组DNA进行片段化，得到DNA片段；S2，采用由dATP、dTTP和dGTP混合形成的dNTP对DNA片段进行末端修复，得到修复片段；S3，对修复片段进行3’末端加“A”，得到3’末端带“A”片段；S4，采用经过“C”到“T”转化处理的接头序列对3’末端带“A”片段进行接头连接，得到带接头片段；S5，对带接头片段进行“C”到“T”转化处理，得到处理片段；S6，对处理片段进行扩增，得到全基因组甲基化测序文库，通过采用不含dCTP的dNTP进行末端修复，避免了非甲基化C的引入，提高了甲基化程度分析的准确性。但是，目前的研究中，只能将序列比对到基因组上，才能得知甲基化位点。还没有一种方法可以是自身作为对照进行甲基化位点定位分析。因此，提供一种甲基化修饰引物并用于以自身为对照进行甲基化位点分析，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
技术实现思路
针对现有技术的不足及实际的需求，本专利技术提供一种Hemi-M甲基化修饰引物及其应用，本专利技术通过设计特异性的甲基化修饰引物，巧妙地与dCTP被mdCTP替代的dNTP相结合，对样本DNA进行胞嘧啶保护，创造性地将其应用于甲基化文库的构建，辅佐以特定的标签，适用于多种应用领域和场景，从而解决文库DNA自身对比分析的问题，实现更准确的甲基化位点分析，具备广阔的应用前景和巨大的市场价值。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种Hemi-M甲基化修饰引物，所述引物至少含有一个被甲基化修饰的胞嘧啶；其中，所述甲基化修饰包括：甲基化、羟甲基化等不能够被重亚硫酸盐处理转化为尿嘧啶(U)的修饰。所述Hemi-M为甲基化Hemi-methylation的缩写。在本专利技术中，专利技术人通过深入研究甲基化在表观遗传学中的作用，广泛探究甲基化研究方法的优缺点，发现甲基化检测的常用方中法，只能将序列比对到基因组上，才能得知甲基化位点，还没有一种方法可以是自身作为对照进行甲基化位点定位分析，因此结合甲基化反应的特性与测序文库的要求，通过大量创造性实验，最终摸索设计得到了一种甲基化修饰引物，能够应用于甲基化检测领域，对DNA链中的胞嘧啶(C)进行甲基化保护，产生一条链正常，另一条链胞嘧啶(C)全部被甲基化胞嘧啶(mdC)代替，从而解决文库DNA自身对比分析的问题，更好的定位甲基化位点。第二方面，本专利技术提供一种PCR方法，所述方法为：采用如第一方面所述的甲基化修饰引物进行PCR扩增反应，对样本DNA链进行胞嘧啶保护，其中，所述PCR扩增的dNTP中的dCTP被mdCTP替代。优选地，所述PCR扩增的反应循环数为1-3个循环，例如可以是1个、2个或3个循环。具体地，所述方法为：将如第一方面所述的甲基化修饰引物与dNTP(含甲基化的mdCTP，不含未甲基化的dCTP)进行甲基化文库构建的CT转化步骤前的扩增反应，对DNA互补链进行胞嘧啶保护。第三方面，本专利技术提供一种甲基化文库的构建方法，所述方法包括如下步骤：(1)将DNA样品进行末端修复，3’端加A，甲基化接头连接；(2)将步骤(1)处理后的产物采用第一方面所述的甲基化修饰引物进行胞嘧啶保护；(3)将步骤(2)处理后的产物进行重亚硫酸盐处理；(4)将步骤(3)处理后的产物进行扩增添加索引序列，得到所述甲基化文库。优选地，若步骤(1)所述的DNA样品为gDNA，所述方法还包括对DNA样品进行片段化处理的步骤。本专利技术中，若步骤(1)所述的DNA样品为cfDNA，则可以直接用于步骤(1)。优选地，所述步骤(1)之前还包括引入标签的步骤。优选地，所述标签的结构为反向互补，正链3’端突出，5’端未被磷酸化，负链5’端被磷酸化。优选地，所述3’端突出为悬突胸腺嘧啶。优选地，所述标签含有鸟嘌呤和胞嘧啶，且与第一方面所述的甲基化修饰引物结合于同一条DNA链上，且标签序列的所有胞嘧啶全部被甲基化修饰。优选地，引入所述标签的方法为：将所述标签引入到DNA片段两端。优选地，所述标签为一条oligo退火形成的茎环结构，且3’端突出，5’端磷酸化。优选地，所述标签为两条oligo退火形成两端或一端互补配对，且3’端突出，5’端磷酸化。本专利技术中，所述标签存在三种情况，当一条链退火形成茎环结构；第二种情况：当两条链发生两端互补配对时形成结构；第三种情况：当两条链发生一端互补配对形成结构，三种情况示意图如图5。优选地，引入所述标签的方法为：将所述标签引入到DNA片段两端，经过处理后形成5’端突出，延伸后形成两端为平末端带标签的DNA片段。本专利技术中，步本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种Hemi‑M甲基化修饰引物，其特征在于，所述引物至少含有一个被甲基化修饰的胞嘧啶；其中，所述甲基化修饰包括甲基化和/或羟甲基化修饰。
【技术特征摘要】
1.一种Hemi-M甲基化修饰引物，其特征在于，所述引物至少含有一个被甲基化修饰的胞嘧啶；其中，所述甲基化修饰包括甲基化和/或羟甲基化修饰。2.一种PCR方法，其特征在于，所述方法为：采用权利要求1所述的引物进行PCR扩增反应，对样本DNA链进行胞嘧啶保护；其中，所述PCR扩增的dNTP中的dCTP被mdCTP替代；优选地，所述PCR扩增的反应循环数为1-3个循环。3.一种甲基化文库的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)将DNA样品进行末端修复，3’端加A，甲基化接头连接；(2)将步骤(1)处理后的产物采用权利要求1所述的甲基化修饰引物进行胞嘧啶保护；(3)将步骤(2)处理后的产物进行重亚硫酸盐处理；(4)将步骤(3)处理后的产物进行扩增添加索引序列，得到所述甲基化文库。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的DNA样品为gDNA，所述方法还包括对DNA样品进行片段化处理的步骤。5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)之前还包括引入标签的步骤...
【专利技术属性】
技术研发人员：张晓妮，屈宏越，许明炎，陈实富，
申请(专利权)人：深圳市海普洛斯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44
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