载脂蛋白检测方法技术

本发明专利技术涉及用于检测和定量样品中的载脂蛋白及其同种型的方法，以及基于根据本发明专利技术所述的检测方法确定的载脂蛋白水平来预测神经退行性或心血管疾病发展概率的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】载脂蛋白检测方法
本专利技术涉及用于检测和定量样品中载脂蛋白及其同种型的方法，以及用于根据以本专利技术的检测方法所确定的载脂蛋白水平来估计神经退行性或心血管疾病发展概率的预测方法。
技术介绍
载脂蛋白E(apoE)是参与脂质代谢的34kDa糖蛋白。编码该蛋白质的人APOE基因是多态的，其位于染色体19上。三种共同的共显性等位基因(ε2、ε3和ε4)编码三种apoE蛋白同种型：E2、E3和E4。这些同种型不同之处在于氨基酸残基112和158。同种型E2在两个位点都具有半胱氨酸残基，E4在两个位点都具有精氨酸残基，而E3(最常见的形式)在112位具有半胱氨酸且在158位具有精氨酸。这些差异对apoE的生物学功能具有深远的影响。这些同种型的脂质结合活性是不同的：E2和E3优先结合高密度脂蛋白(HDL)，而E4优选非常低密度脂蛋白(VLDL)。这些生化差异可能是造成同种型与不同病理过程相关联的原因。同种型E4与较高水平的胆固醇以及冠心病和阿尔茨海默病(Alzheimer以及冠心病和阿尔茨海默)的风险增加有关。相反，同种型体E2显示对阿尔茨海默病的保护作用，但它与家族性III型高脂蛋白血症有关。因此，对APOE基因型或apoE同种型的兴趣对于流行病学研究、患者分层和对临床试验和预防风险增加者的鉴定具有高度的意义。常用几种方法对三种主要APOE单倍型进行基因分型。更常用的方法是：PCR-RFLP(聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性)、毛细管电泳、PCR加测序或质谱、ARMS-PCR(扩增折射突变系统-PCR)和SSP-PCR(简单序列特异性引物-PCR)、荧光熔解曲线的实时PCR检测、FRET(荧光共振能量转移)、等位基因特异性RT-PCR和探针。然而，所有这些基于APOE基因的方法都需要知情同意进行DNA提取和遗传信息分析，并且不能在临床分析例程中轻易实施。主要为了研究目的的几种可选的生物化学(非遗传)方法用于apoE同种型的敏感表征。最常用的是等电聚焦(IEF)和夹心ELISA，其依赖于来自生物流体(如血浆或CSF)的apoE的表征。对于apoE的分析IEF，蛋白质在固定化pH梯度中的等电聚焦之后通过使用抗ApoE抗体免疫检测分离的同种型。具体的apoE带模式允许检测样品中存在的不同apoE同种型。这种技术具有可检测除了apoEE2、E3和E4同种型之外罕见的apoE变体的优势；然而，这对技术要求高且耗时。ELISA(酶联免疫吸附测定)技术使用抗体来捕获靶蛋白。夹心ELISA可用于检查apoEE4同种型的存在，并且依赖于两种抗体(捕获和报道抗体)的使用，其中一种必须是E4同种型特异性抗体。有几种可商购的用于检测apoEE4的ELISA试剂盒(例如ApoE4/泛ApoEELISA试剂盒，MBL#7635)；然而，可能由于固有的技术限制，这种方法尚未在临床常规设置中实施。本领域已经描述了基于载脂蛋白水平预测疾病发展的方法。US5945289Approx涉及通过PCR方法基于对ApoE等位基因进行基因分型评估对象发展前列腺癌的倾向。然而，现有技术仍然需要开发用于载脂蛋白检测和载脂蛋白同种型测定的可靠且准确的方法，其允许快速且可靠地测定样品中的载脂蛋白。所述方法对于预测某些与载脂蛋白或其特定同种型的存在或缺失相关的疾病的发展是有意义的。
技术实现思路
本专利技术的作者开发了用于检测、定量和分析载脂蛋白及其同种型的方法。这种方法基于载脂蛋白与表面特别是聚苯乙烯表面的特定结合特性，其避免了使用捕获抗体或在先分离程序进行检测或定量的需要。作者已经证实，载脂蛋白，特别是apoE，被聚苯乙烯表面(包括ELISA板、luminex珠或比浊珠)特异性捕获。一旦特异的载脂蛋白同种型，例如apoEE4与表面结合，就可以被抗apoE4抗体检测到，从而实现了样品中apoE4同种型的检测和定量。这种定量可以与APOEε4基因型的存在相关联，无论其是杂合性(2/ε4，ε3/ε4)还是纯合性(ε4/ε4)。考虑到这种结合特性对于其他载脂蛋白的是常见的，这种方法也可应用于其他载脂蛋白，包括apoAI、apoAIV、apoCI、apoCII、apoCIII和apoJ(丛生蛋白)。因此，在第一方面，本专利技术涉及用于检测和/或定量样品中的选自apoAI、apoAIV、apoCI、apoCII、apoCIII、apoE和apoJ(丛生蛋白)的载脂蛋白或其同种型的体外方法，所述方法包含：(i)在适合于将载脂蛋白或其同种型结合到聚苯乙烯表面或聚碳酸酯表面的条件下使样品与所述表面接触，其中，该表面不含与所述载脂蛋白或其同种型结合的特异性抗体。(ii)在适合于抗体和载脂蛋白或其同种型之间形成复合物的条件下，使步骤(i)中形成的与载脂蛋白或其同种型结合的表面与所述载脂蛋白或其所述同种型的特异性抗体接触，以及(iii)检测步骤(ii)中形成的复合物，其中，聚苯乙烯表面或聚碳酸酯表面与样品接触之前不进行处理或在接触样品之前被白蛋白封闭。在又一方面，本专利技术涉及用于测定选自apoAI、apoAIV、apoCI、apoCII、apoCIII、apoE和apoJ(丛生蛋白)的给定载脂蛋白的同种型相对于样品中所述载脂蛋白总含量的相对量的体外方法，所述方法包括：(i)在适合于将载脂蛋白结合到聚苯乙烯表面或聚碳酸酯表面的条件下使样品与所述表面接触，其中，该表面不含与所述载脂蛋白结合的特异性抗体，(ii)使步骤(i)形成的与载脂蛋白结合的表面与所述载脂蛋白同种型的特异性第一抗体接触，且与能够结合存在于样品中的所述载脂蛋白的所有同种型的第二抗体接触，其中，所述接触在适合于形成第一复合物和第二复合物的条件下进行，所述第一复合物包括第一抗体和载脂蛋白同种型，所述第二复合物包括第二抗体和所述载脂蛋白的所有同种型，(iii)检测步骤(ii)中形成的第一和第二复合物以及(iv)基于步骤(iii)中获得的第一和第二复合物的水平确定同种型相对于总载脂蛋白含量的相对量，其中，聚苯乙烯表面或聚碳酸酯表面与样品接触之前不进行处理或在接触样品之前被白蛋白封闭。在另一方面，本专利技术涉及用于确定与对象中选自apoAI、apoAIV、apoCI、apoCII、apoCIII、apoE和apoJ(丛生蛋白)的载脂蛋白的载脂蛋白同种型表达相关的单倍型的等位基因剂量的方法，所述方法包括，(i)在适合于将载脂蛋白同种型结合到聚苯乙烯表面或聚碳酸酯表面的条件下，使含蛋白样品与所述表面接触，所述样品来源于所述对象的表达载脂蛋白同种型的组织，其中，该表面不含与所述载脂蛋白同种型结合的特异性抗体。(ii)在适合于抗体和载脂蛋白同种型之间形成复合物的条件下，使步骤(i)中形成的与载脂蛋白结合的表面与至少一种载脂蛋白同种型的特异性抗体接触，(iii)通过将步骤(ii)中形成的复合物的量与编码所述基因变体的等位基因的数量相关联，来确定载脂蛋白同种型的等位基因剂量其中，聚苯乙烯表面或聚碳酸酯表面与样品接触之前不进行处理或在接触样品之前被白蛋白封闭。在另一方面，本专利技术涉及用于确定对象发展神经退行性疾病的概率的方法，所述方法包括通过根据本专利技术所述的任何方法中的一种方法在来自所述对象的样品中确定同种型apoEE4水平，其中如果apoEE4水平高于本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测和/或定量样本中的选自apoAI、apoAIV、apoCI、apoCII、apoCIII、apoE和apoJ(丛生蛋白)的载脂蛋白或其同种型的体外方法，其包含：(i)在适合于将载脂蛋白或其同种型结合到聚苯乙烯表面或聚碳酸酯表面的条件下,使样品与所述表面接触，其中，所述表面不含与所述载脂蛋白或其同种型结合的特异性抗体，(ii)在适合于抗体和载脂蛋白或其同种型之间形成复合物的条件下，使步骤(i)中形成的与载脂蛋白或其同种型结合的表面和所述载脂蛋白或其所述同种型的特异性抗体接触，以及(iii)检测步骤(ii)中形成的复合物，其中，所述聚苯乙烯表面或聚碳酸酯表面与样品接触之前不进行处理或在接触样品之前以白蛋白封闭。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.11.02 EP 15382537.71.用于检测和/或定量样本中的选自apoAI、apoAIV、apoCI、apoCII、apoCIII、apoE和apoJ(丛生蛋白)的载脂蛋白或其同种型的体外方法，其包含：(i)在适合于将载脂蛋白或其同种型结合到聚苯乙烯表面或聚碳酸酯表面的条件下,使样品与所述表面接触，其中，所述表面不含与所述载脂蛋白或其同种型结合的特异性抗体，(ii)在适合于抗体和载脂蛋白或其同种型之间形成复合物的条件下，使步骤(i)中形成的与载脂蛋白或其同种型结合的表面和所述载脂蛋白或其所述同种型的特异性抗体接触，以及(iii)检测步骤(ii)中形成的复合物，其中，所述聚苯乙烯表面或聚碳酸酯表面与样品接触之前不进行处理或在接触样品之前以白蛋白封闭。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述载脂蛋白同种型为apoE4。3.用于确定样品中的选自apoAI、apoAIV、apoCI、apoCII、apoCIII、apoE和apoJ(丛生蛋白)的给定的载脂蛋白的同种型相对于样品中所述载脂蛋白总含量的相对量的体外方法，所述方法包括：(i)在适合于将载脂蛋白结合到聚苯乙烯表面或聚碳酸酯表面的条件下,使样品与所述表面接触，其中，该表面不含与所述载脂蛋白结合的特异性抗体，(ii)使步骤(i)形成的与载脂蛋白结合的表面和所述载脂蛋白同种型的特异性第一抗体接触，且和能够结合存在于样品中的所述载脂蛋白的所有同种型的第二抗体接触，其中，所述接触在适合于形成第一复合物和第二复合物的条件下进行，所述第一复合物包括第一抗体和所述载脂蛋白同种型，所述第二复合物包括第二抗体和所述载脂蛋白的所有同种型，(iii)检测步骤(ii)中形成的第一和第二复合物以及(iv)基于步骤(iii)中获得的第一和第二复合物的水平测定所述同种型相对于总载脂蛋白含量的相对量，其中，所述聚苯乙烯表面或聚碳酸酯表面与样品接触之前不进行处理或在接触样品之前以白蛋白封闭。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(i)中使用的表面由多个实体形成，步骤(ii)中与第一抗体和第二抗体的接触在不同的容器中进行，每个容器包含形成所述表面的所述多个实体的一部分，并且步骤(iii)中的所述检测分别在每个容器中进行。5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述载脂蛋白为apoE且所述载脂蛋白同种型为apoE4。6.用于确定与对象中选自apoAI、apoAIV、apoCI、apoCII、apoCIII、apoE和apoJ(丛生蛋白)的载脂蛋白的载脂蛋白同种型表达相关的单倍型的等位基因剂量的方法，所述方法包括，(i)在适合于将载脂蛋白同种型结合到聚苯乙烯表面或聚碳...

【专利技术属性】
技术研发人员：安德烈·罗德里格斯·马丁，米格尔·卡莱罗·劳拉，奥嘉·卡莱罗·鲁埃达，路易斯·加利西亚·艾伯特，
申请(专利权)人：拜奥克罗斯公司，卡洛斯三世保健中心，神经退行性疾病网络生物医学研究中心，
类型：发明
国别省市：西班牙,ES