一种采用电化学免疫传感器检测S-层蛋白的方法技术

本发明专利技术公开了一种采用电化学免疫传感器检测S‑层蛋白的方法。所述的方法为：首先制备表面修饰石墨烯‑壳聚糖/聚多巴胺/S‑层蛋白单克隆抗体，或纳米金/聚多巴胺/S‑层蛋白单克隆抗体的电化学免疫传感器；然后基于直接免疫法原理，以差分脉冲伏安法对待测样品中的S‑层蛋白进行检测。本发明专利技术所述的S‑层蛋白检测方法快速、高效、灵敏度高，具有极低的检测限(0.025～0.03ng/mL)和非常宽的线性范围(0.2～5000ng/mL)。

【技术实现步骤摘要】
一种采用电化学免疫传感器检测S-层蛋白的方法
本专利技术属于食品安全检测和分析化学
，具体涉及一种采用电化学免疫传感器检测S-层蛋白的方法。
技术介绍
S-层蛋白是存在于细胞膜或细胞壁外的表层蛋白，普遍存在于许多细菌及古生菌表层。有多种乳酸杆菌表面均存在S-层蛋白，关于乳酸菌S-层蛋白的研究主要集中在其提取纯化、功能及作用机制，但针对S-层蛋白的检测方面却鲜少有研究报道。有研究表明嗜酸乳杆菌是具有S-层蛋白的乳酸菌之一。乳酸杆菌S-层蛋白是由蛋白质或者糖蛋白亚基组成，呈规则的晶状排列，形成了能够覆盖整个细胞表面的固态表层。其分子量在21-71kD之间，是已知表层蛋白中分子量最小的一类，占菌体总蛋白的10～15％，一般疏水性氨基酸占31.9～38.7％，含有大量的谷氨酸和天冬氨酸(15％)，赖氨酸的含量也相当高(10％)，极少存在含硫的氨基酸。绝大多数S-层蛋白都是单一的蛋白质或糖蛋白组成的，很少有两种或两种以上蛋白质组成的情况。乳酸杆菌为应用最早、研究最多的益生菌种之一，能够调节肠道微生物区系的平衡，增强机体的免疫力和抵抗力。S-层蛋白在乳酸杆菌黏附过程中起重要作用，因此对乳酸杆菌中的S-层蛋白的检测显得至关重要。目前，常用蛋白质的检测方法有：凯氏定氮法、分子印迹法、双缩脲法、紫外吸收法等，但这些方法有一个共同的缺点：费时费力、价格昂贵或者需要专业的技术人员操作且操作过程比较繁琐，同时灵敏度较低。多巴胺(2-(3，4-二羟基苯基)乙胺)是一种重要的儿茶酚胺类神经递质，具有烷基胺和邻苯二酚等官能团，在含有空气的弱碱性溶液条件下，容易发生自聚合反应成为聚多巴胺(PDOP)。聚多巴胺(PDOP)几乎可以在任何材料表面自发地形成膜状结构，具有很高的生物相容性和还原能力，各种金属、金属氧化物、半导体纳米粒子都可以在聚多巴胺(PDOP)膜的表面进行生长；生物分子在聚多巴胺(PDOP)膜的表面也很容易保持其生物活性。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种采用电化学免疫传感器检测S-层蛋白的方法，所述方法快速、高效、灵敏度极高，具有极低的检测限和非常宽的线性范围。本专利技术的技术方案如下：一种采用电化学免疫传感器检测S-层蛋白的方法，包括以下步骤：步骤1)制备修饰有聚多巴胺和S-层蛋白单克隆抗体的复合电化学免疫传感器；步骤2)标准溶液的配制：配制含有S-层蛋白的磷酸缓冲溶液，作为标准溶液，将含有浓度为0的S-层蛋白的标准溶液作为空白标样；步骤3)S-层蛋白测定方法的建立：将步骤1)制备的复合电化学免疫传感器浸入步骤2)所述含有S-层蛋白的标准溶液中孵育，孵育后用磷酸缓冲溶液冲洗电化学免疫传感器，在K3[Fe(CN)6]溶液中进行差分脉冲伏安扫描，记录其响应电流；以孵育前后响应电流的变化值ΔI对S-层蛋白浓度的对数值lgC作图得ΔI-lgC工作曲线，采用线性回归法得到ΔI-lgC线性回归方程，实现对S-层蛋白的定量检测；步骤4)S-层蛋白的测定：配置含待测样品的磷酸缓冲溶液，加入步骤2)所述标准溶液，测定其响应电流，采用标准加入法计算出待测样品中S-层蛋白的浓度。优选的，步骤1)所述复合电化学免疫传感器为石墨烯-壳聚糖/聚多巴胺/S-层蛋白单克隆抗体修饰的复合电化学免疫传感器，其制备方法如下：先在预处理过的玻碳电极表面修饰石墨烯-壳聚糖复合物，晾干后将其浸入聚多巴胺溶液中，最后在电极表面修饰S-层蛋白单克隆抗体，制得所述复合电化学免疫传感器。优选的，步骤1)所述复合电化学免疫传感器为纳米金/聚多巴胺/S-层蛋白单克隆抗体修饰的复合电化学免疫传感器，其制备方法如下：先将纳米金颗粒通过电化学还原法沉积到预处理过的玻碳电极表面，待电极晾干后将其浸入聚多巴胺溶液中，最后在电极表面修饰S-层蛋白单克隆抗体，制得所述复合电化学免疫传感器。优选的，以步骤2)所述空白标样的测定值标准偏差的3倍作为样品检测限，重复步骤3)可得出S-层蛋白样品的检测限。优选的，步骤4)所述测定方法如下：配置含有待测样品的磷酸缓冲溶液作为待测试样溶液，分取5份等量的待测试样溶液，加入步骤2)所述标准溶液，然后稀释至相同的体积，设定一个浓度Ct作为标准量，使加入的标准溶液的浓度分别为0，Ct、2Ct、3Ct、4Ct，再在上述实验条件下，分别测定待测试样溶液的电流，外延曲线与横坐标相交，交点至原点的距离所相应的浓度Cx，最后可计算出待测样品中S-层蛋白的浓度。与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：本专利技术的采用电化学免疫传感器检测S-层蛋白的方法，方便、快速、成本低廉，灵敏度极高，具有极低的检测限(0.025～0.03ng/mL)和非常宽的线性范围(0.2～5000ng/mL)。附图说明图1为石墨烯-壳聚糖/聚多巴胺/S-层蛋白单克隆抗体修饰的电化学免疫传感器对S-层蛋白进行检测的DPV曲线图；图2为实施例2的响应电流的变化值ΔI与S-层蛋白浓度对数值lgCS的工作曲线图；图3为实际样品1中加标S-层蛋白响应电流的变化值ΔI与S-层蛋白浓度CS的工作曲线图；图4为纳米金/聚多巴胺/S-层蛋白单克隆抗体修饰的电化学免疫传感器对S-层蛋白进行检测的DPV曲线图；图5为实施例5的响应电流的变化值ΔI与S-层蛋白浓度对数值lgCS的工作曲线图；图6为实际样品2中加标S-层蛋白响应电流的变化值ΔI与S-层蛋白浓度CS的工作曲线图。具体实施方式下面结合附图与实施例对本专利技术做进一步阐述，本专利技术的保护范围并不以具体实施方式为限，而是由权利要求加以限定。实施例1石墨烯-壳聚糖/聚多巴胺/S-层蛋白单克隆抗体修饰的电化学免疫传感器的制备先对玻碳电极进行预处理打磨并清洗干净，再将10μL石墨烯-壳聚糖悬浊液滴涂于处理过的玻碳电极表面，置于37℃恒温箱中晾干，之后将上述电极浸泡在1mg/mL的聚多巴胺溶液0.5h，分别进行DPV检测；最后将20μL的S-层蛋白抗体滴涂到电极表面，得到石墨烯-壳聚糖/聚多巴胺/S-层蛋白单克隆抗体修饰的电化学免疫传感器。实施例2石墨烯-壳聚糖/聚多巴胺/S-层蛋白单克隆抗体修饰的电化学免疫传感器对S-层蛋白的检测将实施例1中所述的电化学免疫传感器浸入含有一系列不同浓度的S-层蛋白标准溶液中，在37℃恒温箱中孵育40min后用PBS淋洗，置于含有K3[Fe(CN)6](2mmol/L)的KCl溶液(0.01mol/L)中进行DPV扫描(其DPV曲线图如图1所示)，并记录不同浓度下的峰电流It。图中曲线从上到下(a-j)浓度依次为0.2ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、2000ng/mL、5000ng/mL。定义待检测浓度为零时峰电流值为I0，ΔI为检测样品峰电流与空白浓度峰电流的差值，根据ΔI对S-层蛋白浓度对数值lgCS(ng/mL)作图，得ΔI-lgCS工作曲线，工作曲线图如图2所示，采用线性回归法得到的ΔI-lgCS线性回归方程为ΔI(μA)＝34.5806-1.4359lgCS(ng/mL)，当S-层蛋白浓度在0.2～5000ng/mL范围内其ΔI与lgCS成正比，线性相关系数为0.9947。以空白标样测定值标准偏差的3倍(3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种采用电化学免疫传感器检测S‑层蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1)制备修饰有聚多巴胺和S‑层蛋白单克隆抗体的复合电化学免疫传感器；步骤2)标准溶液的配制：配制含有S‑层蛋白的磷酸缓冲溶液，作为标准溶液，将含有浓度为0的S‑层蛋白的标准溶液作为空白标样；步骤3)S‑层蛋白测定方法的建立：将步骤1)制备的复合电化学免疫传感器浸入步骤2)所述含有S‑层蛋白的标准溶液中孵育，孵育后用磷酸缓冲溶液冲洗电化学免疫传感器，在K3[Fe(CN)6]溶液中进行差分脉冲伏安扫描，记录其响应电流；以孵育前后响应电流的变化值ΔI对S‑层蛋白浓度的对数值lgC作图得ΔI‑lgC工作曲线，采用线性回归法得到ΔI‑lgC线性回归方程，实现对S‑层蛋白的定量检测；步骤4)S‑层蛋白的测定：配置含待测样品的磷酸缓冲溶液，加入步骤2)所述标准溶液，测定其响应电流，采用标准加入法计算出待测样品中S‑层蛋白的浓度。

【技术特征摘要】
1.一种采用电化学免疫传感器检测S-层蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1)制备修饰有聚多巴胺和S-层蛋白单克隆抗体的复合电化学免疫传感器；步骤2)标准溶液的配制：配制含有S-层蛋白的磷酸缓冲溶液，作为标准溶液，将含有浓度为0的S-层蛋白的标准溶液作为空白标样；步骤3)S-层蛋白测定方法的建立：将步骤1)制备的复合电化学免疫传感器浸入步骤2)所述含有S-层蛋白的标准溶液中孵育，孵育后用磷酸缓冲溶液冲洗电化学免疫传感器，在K3[Fe(CN)6]溶液中进行差分脉冲伏安扫描，记录其响应电流；以孵育前后响应电流的变化值ΔI对S-层蛋白浓度的对数值lgC作图得ΔI-lgC工作曲线，采用线性回归法得到ΔI-lgC线性回归方程，实现对S-层蛋白的定量检测；步骤4)S-层蛋白的测定：配置含待测样品的磷酸缓冲溶液，加入步骤2)所述标准溶液，测定其响应电流，采用标准加入法计算出待测样品中S-层蛋白的浓度。2.根据权利要求1所述的一种采用电化学免疫传感器检测S-层蛋白的方法，其特征在于，步骤1)所述复合电化学免疫传感器为石墨烯-壳聚糖/聚多巴胺/S-层蛋白单克隆抗体修饰的复合电化学免疫传感器，其制备方法如下：先在预处理过的玻碳电极表面修饰石墨烯-壳聚糖复合物，晾干后将其浸入聚多巴胺溶液...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵波，王秀文，魏梦，徐红平，邵科峰，潘道东，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32