一种检测新型鸡呼肠孤病毒抗体的间接ELISA检测试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检测新型鸡呼肠孤病毒抗体的间接ELISA检测试剂盒，所述试剂盒包含包被有新型鸡呼肠孤病毒σC蛋白重组抗原的酶标板；所述新型鸡呼肠孤病毒σC蛋白重组抗原的制备方法如下：以保藏编号为CCTCC NO：V201817的鸡呼肠孤病毒的全基因序列为模板，利用引物对扩增得到σC基因片段，构建重组表达载体，通过原核表达系统表达鸡呼肠孤病毒σC蛋白重组抗原。本发明专利技术的间接ELISA检测试剂盒可以对新爆发的以关节肿胀、跛行为主要症状的新型鸡呼肠孤病毒抗体进行快速、有效的检测，以监测鸡群中新型鸡呼肠孤病毒的流行情况。

【技术实现步骤摘要】
一种检测新型鸡呼肠孤病毒抗体的间接ELISA检测试剂盒及应用
本专利技术涉及生物制品
，具体涉及一种检测新型鸡呼肠孤病毒抗体的间接ELISA检测试剂盒及应用。
技术介绍
禽呼肠孤病毒(Avianorthoreovirus，ARV)属于呼肠孤病毒科、正呼肠孤病毒属，是引起鸡病毒性关节炎的病原，主要感染肉鸡，肉蛋兼用型鸡也有感染。ARV主要侵害鸡的跗关节、趾关节、胫跖关节及其肌腱，引起关节滑膜炎或腱鞘炎等。患病鸡通常呈现跛行、蹲坐、不愿走动及食欲减退甚至废绝的症状，造成了饲料转化率低、死淘残鸡增多，降低了生产效益，给家禽养殖业造成严重经济损失。自20世纪80年代中期该病在我国首次报道以来我国ARV的感染情况呈现加重的趋势，临床表现也越来越多样化。2016年，我国山东、江苏等地肉种鸡场和商品代肉鸡场相继以关节肿胀和跛行为症状的疾病。该病传播速度快、发病范围广，不同日龄、不同品种的鸡都可以感染，但对商品肉鸡的危害尤为严重。发病初期主要表现为体温升高、精神沉郁、食欲废绝及营养吸收不良等，随着病程的发展，感染鸡逐渐出现关节肿胀、发炎，不愿走动，跛行等症状；剖检可见关节腔内纤维素性渗出，腱鞘炎，腓肠腱断裂等病理变化，给我国肉鸡养殖业造成严重的经济损失。研究证实，这种以关节炎为主要症状的高发病率鸡传染病的病原为一种新型的鸡呼肠孤病毒，属于新发传染病，对该病毒的生物学特性、致病机制等的研究尚处于起步阶段，目前仍缺少有效的疫苗免疫和预防控制措施，对于该新型病毒的血清学检测方法目前也尚未有报道。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种检测新型鸡呼肠孤病毒抗体的间接ELISA检测试剂盒及应用。可以对新爆发的以关节肿胀、跛行为主要症状的新型鸡呼肠孤病毒抗体进行快速、有效的检测，以监测鸡群中新型鸡呼肠孤病毒的流行情况。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一方面，提供一种检测新型鸡呼肠孤病毒抗体的间接ELISA检测试剂盒，所述间接ELISA检测试剂盒包含包被有新型鸡呼肠孤病毒σC蛋白重组抗原的酶标板；所述新型鸡呼肠孤病毒σC蛋白重组抗原的制备方法如下：以保藏编号为CCTCCNO：V201817的鸡呼肠孤病毒的全基因序列为模板，利用引物对扩增得到σC基因片段，构建重组表达载体，通过原核表达系统表达新型鸡呼肠孤病毒σC蛋白重组抗原；所述引物对包括：上游引物σc-F:5’-ATGGACGGATTAACTCAACAGCA-3’；(SEQIDNO.1)下游引物σC-R:5’-TTAGGTATCGATGCCCGTACGCAC-3’。(SEQIDNO.2)进一步的，将所述重组表达载体转化至BL21(DE3)感受态细胞中，加入IPTG进行诱导表达；将表达产物经过变性和复性后，获得纯化的新型鸡呼肠孤病毒σC蛋白重组抗原。作为优选，所述新型鸡呼肠孤病毒σC蛋白重组抗原的包被量为500ng/孔。进一步的，所述间接ELISA检测试剂盒还包含：酶标抗体、样品稀释液、洗涤液、阴性对照血清、阳性对照血清、底物显色液A、B和终止液。优选的，所述酶标抗体为酶标兔抗鸡抗体。上述间接ELISA检测试剂盒在新型鸡呼肠孤病毒的流行病学调查中的应用也是本专利技术的保护范围；所述新型鸡呼肠孤病毒的保藏编号为CCTCCNO：V201817。本专利技术的第二方面，提供一种新型鸡呼肠孤病毒抗体的间接ELISA检测方法，包括以下步骤：(1)包被：以保藏编号为CCTCCNO：V201817的新型鸡呼肠孤病毒σC重组蛋白作为包被抗原，将抗原稀释后加入到酶标板孔中，4℃孵育过夜或37℃孵育2-4h，采用含0.05％吐温的PBST洗涤；(2)封闭：采用PBST稀释5％脱脂奶粉200μL/孔进行封闭，37℃条件下孵育1h后甩干，用PBST洗涤；(3)血清作用条件：每孔加入待检血清稀释混合液，37℃条件下孵育1h后甩干，用PBST洗涤；(4)添加酶标抗体：将酶标兔抗鸡抗体用PBST按1：500稀释，每孔加100μl，37℃条件下作用1h后甩干，用PBST洗涤；(5)底物显色：TMB底物显色液100μL/孔，37℃条件下避光作用15min；(6)终止反应：每孔加50μL终止液终止显色反应；采用酶标仪吸光度450nm下读取数据；(7)阴阳性临界值的确定：根据公式：阴阳性临界值＝阴性样本OD450平均值+标准偏差3SD，得到阴阳性临界值；当OD450在0.071以上，判定为阳性。步骤(1)中，所述新型鸡呼肠孤病毒σC重组蛋白由如下方法制备而成：以保藏编号为CCTCCNO：V201817的新型鸡呼肠孤病毒的全基因序列为模板，利用引物对扩增得到σC基因片段，构建重组表达载体；将重组表达载体转化至BL21(DE3)感受态细胞中，加入IPTG进行诱导表达；将表达产物经过变性和复性后，获得纯化的鸡呼肠孤病毒σC重组蛋白；所述引物对包括：上游引物σc-F:5’-ATGGACGGATTAACTCAACAGCA-3’；(SEQIDNO.1)下游引物σC-R:5’-TTAGGTATCGATGCCCGTACGCAC-3’。(SEQIDNO.2)本专利技术的有益效果：针对新发现的能够导致肉鸡关节肿胀、跛行的新型鸡呼肠孤病毒，本专利技术建立了检测该新型鸡呼肠孤病毒抗体的间接ELISA检测方法，该检测方法具有简便、快速、稳定、特异性强、灵敏度高等特性，能够对鸡群中新型鸡呼肠孤病毒σC特异性抗体进行检测，并以此为依据来检测鸡群中呼肠孤病毒的抗体水平，从而监测鸡群中新型鸡呼肠孤病毒的流行情况。附图说明图1：重组蛋白σC在BL21感受态中诱导表达及蛋白纯化SDS-PAGE分析图；其中，M泳道为蛋白质标准；第1泳道为空载，第二泳道为未诱导全菌，第3泳道为诱导菌裂解后上清，第4泳道为诱导菌裂解后沉淀。图2：WesternBlotting分析结果。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。正如
技术介绍
所介绍的，2016年，我国山东、江苏等地肉种鸡场和商品代肉鸡场相继以关节肿胀和跛行为症状的疾病。该病传播速度快、发病范围广，不同日龄、不同品种的鸡都可以感染，但对商品肉鸡的危害尤为严重。发病初期主要表现为体温升高、精神沉郁、食欲废绝及营养吸收不良等，随着病程的发展，感染鸡逐渐出现关节肿胀、发炎，不愿走动，跛行等症状；剖检可见关节腔内纤维素性渗出，腱鞘炎，腓肠腱断裂等病理变化，给我国肉鸡养殖业造成严重的经济损失。研究发现该病的流行是由新型鸡呼肠孤病毒引起的。目前尚无能够有效控制该新型鸡呼肠孤病毒感染的药物和方法。我们知道，禽呼肠孤病毒的宿主范围较广，各种禽类中普遍存在这种病毒，自1954年以来已经在鸡、鹅、鸽子、鸵鸟、鸭、火鸡及其它野鸡等多种发病或是健康的禽类中分离到呼肠孤病毒，而从不同宿主中分离到的呼肠孤病毒其存在较大的变异性，其致病性、基因序列和主要蛋白的编码都存在差异。本申请专利技术人从具有关节肿胀、跛行症状的肉鸡肌腱组织中分离出一株N-ARV-LY383，禽类呼肠孤病毒基因由分节段的10个基因片段(包括：L1-L3、M1-M3、S1-S4)组成，本专利技术对上述新分离的鸡呼肠孤病毒N-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测新型鸡呼肠孤病毒抗体的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述间接ELISA检测试剂盒包含包被有新型鸡呼肠孤病毒σC蛋白重组抗原的酶标板。

【技术特征摘要】
1.一种检测新型鸡呼肠孤病毒抗体的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述间接ELISA检测试剂盒包含包被有新型鸡呼肠孤病毒σC蛋白重组抗原的酶标板。2.根据权利要求1所述的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述新型鸡呼肠孤病毒σC蛋白重组抗原的制备方法如下：以保藏编号为CCTCCNO：V201817的鸡呼肠孤病毒的全基因序列为模板，利用引物对扩增得到σC基因片段，构建重组表达载体，通过原核表达系统表达新型鸡呼肠孤病毒σC蛋白重组抗原；所述引物对的序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。3.根据权利要求2所述的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，将所述重组表达载体转化至BL21(DE3)感受态细胞中，加入IPTG进行诱导表达；将表达产物经过变性和复性后，获得纯化的新型鸡呼肠孤病毒σC蛋白重组抗原。4.根据权利要求1所述的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述新型鸡呼肠孤病毒σC蛋白重组抗原的包被量为500ng/孔。5.根据权利要求1-4任一项所述的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述间接ELISA检测试剂盒还包含：酶标抗体、样品稀释液、洗涤液、阴性对照血清、阳性对照血清、底物显色液A、B和终止液。6.根据权利要求5所述的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述酶标抗体为酶标兔抗鸡抗体。7.权利要求1-6任一项所述的间接ELISA检测试剂盒在新型鸡呼肠孤病毒的流行病学调查中的应用；所述新型鸡呼肠孤病毒的保藏编号为CCTCCNO：V201817。8.一种新型鸡呼肠孤病毒抗体的间接ELISA检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)包被：以保藏编号为CC...

【专利技术属性】
技术研发人员：刁有祥，唐熠，刘赫，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37