一株高产核酸酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种高产核酸的酿酒酵母菌株及其构建方法与应用，包括基因过表达以及选育菌株的发酵验证。以Pep1基因为目的基因，选育的酵母菌株对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)液泡蛋白分选受体Pep1进行过表达，与亲本菌株相比，所构建的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株基本发酵性能不受影响，摇瓶发酵后，选育菌株核酸含量达14.70％，亲本菌株核酸含量为9.32％，选育菌株相比较亲本菌株提高了57.72％。选育的酿酒酵母菌株显著提高核酸含量，在酵母及核酸产业广泛的应用。

【技术实现步骤摘要】
一株高产核酸酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用
本专利技术属于生物工程
，涉及工业微生物的育种，特别是一种高产核酸的酿酒酵母工程菌。
技术介绍
核酸酵母工业是我国新兴产业。核糖核酸(简称核酸,RNA)广泛应用于食品工业、医药工业和农业生产上。在食品工业方面,核酸是开发新型食品调味品必不可少的原料。风行世界的第二代味精(强力味精)、第三代味精(风味味精)、特鲜酱油等新型调味品,都是核酸及其衍生物应用的结果。在医药工业上,核酸是制造治疗冠心病、肿瘤、心肌梗塞等疾病药物的原料。在农业上,核酸及其衍生物广泛用作农作物(如水稻、瓜果、豆类等)的生长促进物质。酿酒酵母胞内RNA主要包括：信使RNA，核糖体RNA，转运RNA和非编码RNA。其中核糖体RNA是其中含量最多的一类RNA，占RNA总量的82％左右，也是其中相对分子质量最大的一类RNA。所以增加胞内核糖体RNA的产量或者生成速率是一种有效的选育高核酸酿酒酵母的方法。近年来随着对食品安全性的考虑，越来越多的研究集中在选育高核酸酿酒酵母的工作方面，而非假丝酵母等不属于GRAS(Generallyrecognizedassafe)的菌株。杨依顺,丁玥,曹静,等.酿酒酵母发酵制备RNA的研究[J].药物生物技术,2013(4):310-313.利用氯化钾敏感性，通过DES化学诱变，筛选一株酿酒酵母，RNA含量提高了25％。文章ChuwattanakulV,KimYH,SugiyamaM,etal.ConstructionofaSaccharomycescerevisiaestrainwithahighlevelofRNA.[J].JournalofBioscience&Bioengineering,2011,112(1):1通过敲除酿酒酵母中RRN10基因，然后通过EMS诱变筛选获得回复突变株，最后通过在突变株内整合表达RRN10基因，获得高产核酸的酵母菌株，使核酸含量提高了30％。文章PetersonMR,EmrSD.TheclassCVpscomplexfunctionsatmultiplestagesofthevacuolartransportpathway.[J].Traffic,2001,2(7):476-486，曾经公开了液泡蛋白分选受体PEP1(也称为VPS10或VPT1)的功能，指出其在蛋白质分泌过程中起到非常关键的作用。其主要涉及可溶性CPY蛋白从液泡前的细胞器(例如核内体)到液泡之间的运输。文章Marcusson,EricG,Horazdovsky,etal.ThesortingreceptorforyeastvacuolarcarboxypeptidaseYisencodedbytheVPS10gene[J].Cell,1994,77(4):579中指出：亚细胞分级的方法将PEP1(也称为VPS10或VPT1)基因定位于高尔基体后期，用于从核内体到高尔基体的蛋白质分选。在酿酒酵母中PEP1蛋白处于细胞质尾部结构域，通过从高尔基体到核内体的反复循环执行多轮分选：蛋白片段CPY的分选信号PEP1蛋白与p2PCY相互作用，形成受体——配体复合体，该复合体被包装成小泡，PEP1蛋白释放p2PCY，然后受体PEP1回到高尔基体继续新一轮的分选，CPY前体物继续被运输到液泡，直到其活性形成。当PEP1缺失时，虽然CPY蛋白质从内质网运输到高尔基体的过程是连续的，但是由于缺少细胞质的尾部结构受体，因此CPY前体物质被分泌到内质网，并不能被运输到液泡，进而不能激活其活性，从而影响细胞的生理活性。目前本
针对于液泡蛋白分选受体的研究基本关注于该蛋白的功能性对于细胞生理活性的影响。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决产核酸酵母菌株菌种性能低，核酸产量低的问题，提供一株高产核酸的酿酒酵母。为解决上述技术问题，本专利技术技术方案如下：一株高产核酸酿酒酵母工程菌，是以酿酒酵母菌为出发菌株，通过基因工程手段过表达液泡蛋白分选受体基因PEP1(也称为VPS10或VPT1)得到，所述PEP1基因序列如SEQIDNO.1所示。所述PEP1基因的GeneID为：852264。进一步地，所述高产核酸酿酒酵母工程菌是通过构建强启动子与液泡蛋白分选受体基因PEP1以及筛选标记基因的连接片段，通过同源重组的方法，将连接片段以rDNA非转录间隔区域1(NTS1)作为插入位点整合到宿主菌酿酒酵母的基因中，从而获得重组工程菌。进一步地，所述rDNA为酿酒酵母25srDNA(GeneID:9164935)、5.8srDNA(GeneID:9164934)、18srDNA(GeneID:9164923)序列，rDNA核酸序列见核酸序列表SEQIDNO.2。优选地，所述出发菌株为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)W303a。优选地，所述强启动子为强启动子PGK1。优选地，所述筛选标记基因为Kan基因片段。优选地，所述宿主菌为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)W303a。本专利技术的另一目的在于提供上述高产核酸酿酒酵母工程菌的构建方法，具体步骤如下：(1)将强启动子PGK1连接到载体质粒Yep352上，得到重组质粒Yep352-PGK1；(2)以酿酒酵母W303a的总DNA基因组为模板，PCR扩增，得到PEP1基因片段，将PEP1基因片段连接到重组质粒Yep352-PGK1上，得到重组质粒Yep352-PGK1-PEP1；(3)以重组质粒Yep352-PGK1-PEP1为模板经PCR扩增，得到强启动子PGK1和PEP1连接片段；(4)以出发酿酒酵母菌株W303a基因组为模板PCR得到插入位点rDNA非转录间隔区域1的上游同源臂和下游同源臂；(5)将步骤(3)(4)中得到的片段以及筛选标记Kan片段通过醋酸锂转化法转化到出发酿酒酵母菌株中，其中上游同源臂、Kan片段、PGK1和PEP1连接片段、下游同源臂顺序连接，并筛选得到多拷贝表达PEP1基因的工程菌。进一地，所述步骤(1)中，所述上游同源臂为rDNA-A片段，所述下游同源臂为rDNA-B片段。优选地，所述带有筛选标记的Kan片段的获得方法为：以质粒PUC6为模板PCR得到筛选标记基因Kan片段。本专利技术的另一目的是提供将上述高产核酸酿酒酵母工程菌应用于生产核酸中的用途。优选地，所述高产核酸酿酒酵母工程菌的发酵方法如下：种子液培养：将菌泥从斜面上挑取一环，将酿酒酵母工程菌接种到YPD培养基试管中，28-30℃、180-190rpm条件下培养10-12h，得到种子液；发酵培养：将种子液按照接种量3-5％(体积百分比)接种于YPD液体培养基中，28-30℃、180-190rpm条件下发酵培养4h。上文中，所述整合位点参照文章如下：SunH,ZangX,LiuY,etal.Expressionofachimerichuman/salmoncalcitoningeneintegratedintotheSaccharomycescerevisiae,genomeusingrDNAsequencesasrecombinationsites[J].AppliedMicrobiology&Biot本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株高产核酸酿酒酵母工程菌，是以酿酒酵母菌为出发菌株，其特征在于：通过基因工程手段过表达液泡蛋白分选受体基因PEP1得到，所述PEP1基因序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一株高产核酸酿酒酵母工程菌，是以酿酒酵母菌为出发菌株，其特征在于：通过基因工程手段过表达液泡蛋白分选受体基因PEP1得到，所述PEP1基因序列如SEQIDNO.1所示。2.如权利要求1所述的一株高产核酸酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述高产核酸酿酒酵母工程菌是通过构建强启动子与液泡蛋白分选受体基因PEP1以及筛选标记基因的连接片段，通过同源重组的方法，将连接片段以rDNA非转录间隔区域1作为插入位点整合到宿主菌酿酒酵母的基因中，从而获得重组工程菌。3.如权利要求1或2所述的一株高产核酸酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述出发菌株为酿酒酵母W303a。4.如权利要求2所述的一株高产核酸酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述强启动子为强启动子PGK1。5.如权利要求2所述的一株高产核酸酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述筛选标记基因片段为Kan基因片段。6.如权利要求2所述的一株高产核酸酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述宿主菌为酿酒酵母W303a。7.一种高产核酸酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，具体如下：(1)将强启动子PGK1连接到载体质粒Yep352上，得到重组质粒Yep352-PGK1；(2)以酿酒酵母W3...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭学武，倪晓丰，王东旭，肖冬光，陈叶福，赵宾，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津,12