一种产柠檬烯的解脂耶氏酵母及其构建方法与应用技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，涉及一株产生柠檬烯的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用。所述基因工程菌为解脂耶氏酵母宿主中导入D柠檬烯合酶基因或L‑柠檬烯合酶基因并且过表达甲羟戊二酸单酰辅酶A还原酶基因(HMGR)基因所得。在YPD培养基中摇瓶发酵后，能够异源合成柠檬烯，产D‑柠檬烯的工程菌株异源合成D‑柠檬烯的产量为0.6305mg/L，产L‑柠檬烯的工程菌株异源合成L‑柠檬烯的产量为0.3672mg/L。

【技术实现步骤摘要】
一种产柠檬烯的解脂耶氏酵母及其构建方法与应用
：本专利技术属于分子生物学
，涉及一种产生柠檬烯的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用。
技术介绍
：解脂耶氏酵母是一种具有典型代表性的非常规酵母。该酵母无致病性，最高生长温度一般在34℃以下，并且已经被认定为GRAS(generallyregardedassafe)安全级微生物。与酿酒酵母不同，该酵母为严格好氧菌，并具有二型性生长的特点，碳源、氮源、pH等生长条件都会影响该菌的菌落形态，因此它成为了研究酵母及真菌菌丝分化的模式菌株。该酵母的另外一个显著优点是它广泛存在于各类食物和各种生存环境中，这是因为其可以利用的碳源类型极为广泛，包括有机酸、烷烃、烯烃、油类、醇类、酯类等。此外，解脂耶氏酵母在其代谢过程中能够产生和分泌多种代谢产物，包括蛋白酶、脂肪酶、磷酸酶、赖氨酸、γ-癸内酯、柠檬酸、异柠檬酸和α-酮戊二酸等。由于解脂耶氏酵母具有以上这些生理、代谢特征和独特优势，因此它也成为了生物化学品等各种产品生产的潜在微生物细胞工厂。早期的研究工作主要是利用解脂耶氏酵母发酵生产各种代谢产物。随着分子生物学的发展，解脂耶氏酵母的全基因组测序工作已经完成，基因表达载体和遗传转化方法也相继建立并不断发展完善。这些都为新型酵母表达系统—解脂耶氏酵母表达系统的开发奠定了良好基础。利用代谢工程和合成生物学技术对解脂耶氏酵母进行改造来改进自身代谢产物的生产以及合成新的目标产物，已成为目前的一个研究热点。柠檬烯是一种植物来源的天然活性化合物，具有很高的市场价值。柠檬烯属于单环单萜类化合物，化学式为C10H16，有右旋体(D型，图1A)、左旋体(L型，图1B)和外消旋体三种异构体。D-柠檬烯有类似柠檬或甜橙的悦人香味，并且已经被认定为GRAS(generallyregardedassafe)化合物，因此作为优质香精香料被广泛应用于食品、饮料、化妆品、化学和医药工业中。L-柠檬烯则有类似松油和松脂的气味，也具有芳香添加用途。D-柠檬烯还是一种天然、绿色、环保的工业清洗剂，被广泛应用于印刷、机械、航空、电子和电器工业部件的清洗。在农业上，D-柠檬烯还作农作物被用的生物杀虫剂。L-柠檬烯和D-柠檬烯还是极具潜力的新型生物燃料和生物材料。此外，以L-柠檬烯和D-柠檬烯作为前体物，可以转化合成多种具有高附加值的工业产品。最新的研究表明L-柠檬烯和D-柠檬烯都有很好的药用价值，例如D-柠檬烯具有抑菌抗菌活性，可以作为良好的天然抗菌活性物质；D-柠檬烯还具有抗癌活性、促进消化和减肥作用。柠檬烯的市场需求正越来越大，但由于从植物组织中提取这些宝贵的天然产物存在着植物来源有限、目标物质含量低和分离提取难度大等缺点，因此利用微生物生产这些植物来源的天然产物就具有独特优势，也引起了越来越多研究者的关注。目前关于利用微生物代谢工程技术生产柠檬烯的研究并不多见，主要集中在大肠杆菌和酿酒酵母这两种模式菌株中，但是产量并不高，难以实现工业化。针对柠檬烯在大肠杆菌和酿酒酵母中合成产量低的问题，可能存在诸多原因，有待于进行进一步的探索。而为柠檬烯的生物合成寻找新的、更理想的微生物宿主是一个很好的研究方向，借此可以找到柠檬烯合成代谢通路与微生物宿主之间的最大兼容性。
技术实现思路
：本专利技术所要解决的技术问题就是针对目前柠檬烯异源合成产量低的问题，提供一株导入D-柠檬烯合酶基因(DLS)或L-柠檬烯合酶基因(LLS)的解脂耶氏酵母基因工程菌以及该菌株在异源合成柠檬烯的应用，其能够合成柠檬烯以及通过代谢工程或合成生物学手段构建能够提高柠檬烯产量的工程菌株。本专利技术的技术方案之一是：提供一种解脂耶氏酵母基因工程菌，所述基因工程菌为解脂耶氏酵母宿主中导入D柠檬烯合酶基因或L-柠檬烯合酶基因并且过表达甲羟戊二酸单酰辅酶A还原酶基因(HMGR)基因所得。所述D-柠檬烯合酶基因序列是将GenBank登录号为AF514289.1的核苷酸序列5＇端截去210bp以及3＇端截去262bp并在前后分别加上起始密码子ATG和终止密码子TGA后经密码子优化并添加his标签得到，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：1所示；所述L-柠檬烯合酶基因序列是将GenBank登录号为L13459.1的核苷酸序列5＇端截去196bp以及3＇端截去345bp并在前后分别加上起始密码子ATG和终止密码子TGA后经密码子优化并添加his标签得到，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：2所示；所述HMGR基因Genebank登录号为XM_503558，核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：3所示；优选的，所述解脂耶氏酵母宿主为解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)Po1gku70Δ。所述解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)Po1gku70Δ是在解脂耶氏酵母Po1g菌株中敲除KU70基因获得的，其构建方法参考文献Geneticengineeringofanunconventionalyeastforrenewablebiofuelandbiochemicalproduction.JournalofVisualizedExperiments,2016,115,e54371。所述解脂耶氏酵母Po1g菌株购买自中国台湾的YeasternBiotechCo.公司。本专利技术的技术方案之二是：提供一种技术方案一所述解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：(1)将D-柠檬烯合酶基因或L-柠檬烯合酶基因分别与HMGR基因插入质粒中，得到重组质粒；(2)将重组质粒线性化后导入所述出发菌株中，重组后得到所述基因工程菌。具体如下：(1)重组质粒的构建①根据Genebank中的D-柠檬烯合酶基因和L-柠檬烯合酶基因的核苷酸序列以解脂耶氏酵母密码子使用偏好性分别进行密码子优化，并在基因3′端加入His标签，之后进行基因合成；②以带有合成基因的质粒为模板，PCR扩增出D-柠檬烯合酶基因和L-柠檬烯合酶基因；③根据Genebank中的HMGR基因序列设计并合成引物，以解脂耶氏酵母Po1gku70Δ的基因组为模板扩增HMGR基因；④将②和③中获得的D-柠檬烯合酶基因、L-柠檬烯合酶基因和HMGR基因分别插入到pYLEX1质粒的多克隆位点上，分别得到重组质粒pYLEX1-D、pYLEX1-L和pYLEX1-HMGR；⑤从重组质粒pYLEX1-HMGR上PCR扩增出HMGR表达盒，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO：3所示，然后将HMGR表达盒分别克隆到质粒pYLEX1-D和pYLEX1-L上，分别得到重组质粒pYLEX1-DHR和pYLEX1-LHR；(2)获得基因工程菌①将步骤(1)中的重组质粒pYLEX1-DHR和pYLEX1-LHR线性化；②用醋酸锂转化法将①中的线性化载体分别转化入宿主菌株中；③用亮氨酸缺陷板筛选转化子，挑选长出的菌株即得到重组后的基因工程菌株。所述pYLEX1质粒是一种用于基因导入的重组质粒，其依次含有营养缺陷筛选基因亮氨酸表达盒、标记基因Amp、启动子hp4d、以及终止子XPR2term。pYLEX1质粒购买自中国台湾的YeasternBiotechCo.公司本专利技术的技术方案之三是：提供技术方案一所述基因工程菌应用于异源合成柠檬烯本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为解脂耶氏酵母宿主中导入D柠檬烯合酶基因或L‑柠檬烯合酶基因，并且过表达甲羟戊二酸单酰辅酶A还原酶基因HMGR基因所得。

【技术特征摘要】
1.一种解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为解脂耶氏酵母宿主中导入D柠檬烯合酶基因或L-柠檬烯合酶基因，并且过表达甲羟戊二酸单酰辅酶A还原酶基因HMGR基因所得。2.如权利要求1所述的一种解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，所述D柠檬烯合酶基因其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：1所示；所述L柠檬烯合酶基因其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：2所示；所述HMGR基因其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：3所示。3.如权利要求1所述的一种解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，所述解脂耶氏酵母宿主为解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)Po1gku70Δ。4.权利要求1所述的一种解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，具体如下：(1)将D-柠檬烯合酶基因或L-柠檬烯合酶基因分别与HMGR基因插入质粒中，得到重组质粒；(2)将重组质粒线性化后导入所述出发菌株中，重组后得到所述基因工程菌。5.如权利要求4所述的一种解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，具体如下：(1)重组质粒的构建①将D-柠檬烯合酶基因、L-柠檬烯合酶基因和HMGR基因分别插入到pYLEX1质粒的多克隆位点上，分别得到重组质粒pYLEX1-D、pYLE...

【专利技术属性】
技术研发人员：于爱群，庞亚如，赵雅坤，张翠英，肖冬光，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津,12