一种提高麦汁过滤性能的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶制造技术

本发明专利技术公开了一种提高麦汁过滤性能的α‑L‑阿拉伯呋喃糖苷酶，属于生物工程技术领域。本发明专利技术对α‑L‑阿拉伯呋喃糖苷酶的基因进行了修饰，去除了内含子，信号肽和终止密码子序列，其修饰后的α‑L‑阿拉伯呋喃糖苷酶的基因序列如SEQ ID NO.4所示，对应的氨基酸的序列如SEQ ID NO.2所示。将修饰后的α‑L‑阿拉伯呋喃糖苷酶基因序列与表达载体pPIZαA连接，构建重组表达载体pPIZαA‑QAnabfA并在毕赤酵母X33中表达获得重组α‑L‑阿拉伯呋喃糖苷酶。将重组α‑L‑阿拉伯呋喃糖苷酶应用到麦汁的制造中提高麦汁的过滤速度。

【技术实现步骤摘要】
一种提高麦汁过滤性能的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶
本专利技术涉及一种提高麦汁过滤性能的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶，属于生物工程

技术介绍
阿拉伯木聚糖(arabinoxylans，AX)是半纤维素的主要成分，其基本结构是以β-(1→4)-D吡喃木糖残基为线形骨架，同时在C(O)-3，(O)-2或C(O)-2，3键联上α-L-阿拉伯呋喃糖残基为侧链取代基。AX的降解需要多种酶的协同作用，如内切β-木聚糖酶、外切β-木聚糖酶、β-木糖苷酶和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶等。在大麦麦芽中AX的含量为3.1％～4.0％，水溶性阿拉伯木聚糖(water-extractablearabinoxylans,简称WEAX)的含量为0.49％～0.69％。AX在麦汁的制造过程中会产生很多问题，尤其是多聚阿拉伯木聚糖(polymericarabinoxylans,简称PAX)，比如降低麦汁的过滤速度，增加麦汁的粘度等。但在AX的降解过程中，L-阿拉伯呋喃糖残基的存在阻碍了其它水解酶与AX的有效结合，进而降低了水解酶对AX的降解效率，影响麦汁的过滤性能。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶苷酶(α-L-Arabinofuranosidase,简称AnabfA)存在于糖基水解酶的第3、43、51、54、62和127家族。它可特异性地从L-阿拉伯糖多糖或寡糖残基的非还原末端α-L-1,2-，α-L-1,3-和α-L-1,5-位点水解生成一个阿拉伯糖。AnabfA已经在一些细菌，真菌和植物中获得，但由于酶活较低，不具备工业化应用价值。根据已发表的文献报道，产α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的真菌主要为一些曲霉，如黑曲霉(Aspergillusniger)，米曲霉(Aspergillusoryzae)，构巢曲霉(Aspergillusnidulans)，日本曲霉(Aspergillusjaponicus)等，除此之外还有一些白腐真菌(Phanerochaetechrysosporium)，腐质霉(Humicolainsolens)，里氏木霉(Trichodermareesei)，产黄青霉(Penicilliumchrysogenum),出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)等也产阿拉伯呋喃糖苷酶。来源于真菌的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的最适反应pH偏酸性，pH范围为4-5.5，最适反应温度为中高温，温度范围一般为50℃左右，少数温度偏高可达到75℃。分子量范围在40kDa-110kDa。在细菌中，产阿拉伯呋喃糖苷酶的有类芽孢杆(Paenibacillus)，双歧杆菌(Bifidobacterium)，烟草芽孢杆菌(Anoxybacilluskestanbolensis)，链霉菌属(Streptomyces)等，来源于细菌的阿拉伯呋喃糖苷酶的最适反应pH一般比真菌来源阿拉伯呋喃糖苷酶偏碱性，pH范围为4.5-6之间，大多数为6左右，最适反应温度为50-65℃之间。还有一些来自于极端环境中的细菌，它们的最适反应温度，pH等差异就比较大。如来自嗜热菌ThermotogathermarumDSM5069的阿拉伯呋喃糖苷酶的最适反应温度为80℃，来自于嗜热厌氧菌ThermoanaerobacterethanolicusJW200的阿拉伯呋喃糖苷酶75℃的半衰期为1h，来自于枝顶孢菌Acremoniumsp.WCQ-6A的阿拉伯呋喃糖苷酶最适反应温度为25℃，来源于嗜酸菌Rhodotorulaflava的阿拉伯呋喃糖苷酶最适反应pH为2.0等。目前对植物中的阿拉伯呋喃糖苷酶的研究的主要对象为大麦麦芽中的阿拉伯呋喃糖苷酶，麦芽中的阿拉伯呋喃糖苷酶的最适反应温度和pH分别为60和4.5左右。克隆表达的宿主菌一般为大肠杆菌和毕赤酵母，来源于原核生物的基因一般在大肠杆菌中表达，来源于真核生物的基因一般于毕赤酵母中进行异源表达。目前，国内外对AnabfA的研究重视程度不够，尚未有商品化的酶问世，而且对AnabfA的应用研究也比较少。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种基因工程菌，以毕赤酵母为宿主，以pPICZαA为载体，表达SEQIDNO.1所示的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶。在本专利技术的一种实施方式中，所述宿主为毕赤酵母X-33。本专利技术的第二个目的是提供构建所述基因工程菌的方法，是将SEQIDNO,2所示的编码α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的基因插入到表达质粒pPICZαA的限制性内切酶EcoRI和NotI之间的位点上，获得重组表达载体pPICZαA-QAnabfA，再转化至毕赤酵母中进行表达。在本专利技术的一种实施方式中，SEQIDNO.2所示的编码α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的基因是在SEQIDNO.3的基础上，去除编码信号肽、内含子和终止子序列的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因序列。在本专利技术的一种实施方式中，用限制性内切酶SacI线性化重组表达载体pPICZαA-QAnabfA，再通过电转化的方法转入到毕赤酵母中。本专利技术的第三个目的是提供一种制备重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶苷酶的方法。包括以下步骤(1)重组表达载体pPICZαA-QAnabfA整合到毕赤酵母的基因组上，得到重组菌株。(2)培养重组菌株，诱导重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶苷酶的表达,；(3)回收并纯化重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶苷酶。在本专利技术的一种实施方式中，将所述基因工程菌在BMGY中进行种子扩大培养，将扩培的种子液接种于BMMY中进行诱导发酵；发酵条件为：发酵于500mL的三角瓶中进行，装液量100mL，温度30℃，转速200r/min，诱导剂甲醇的添加量为每24h添加1％的甲醇，发酵时间为4d。本专利技术的第四个目的是提供上述重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶苷酶的应用。在本专利技术的一种实施方式中，所述应用包括用于大麦麦芽麦汁的制造中。在本专利技术的一种实施方式中，所述应用是在大麦麦芽糖化的初始阶段添加重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶。在本专利技术的一种实施方式中，重组酶的添加量为20～50mU/g绝干麦芽。在本专利技术的一种实施方式中，重组酶的添加量为31.2mU/g绝干麦芽。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶苷酶与木聚糖酶协同作用于大麦麦芽汁中。在本专利技术的一种实施方式中，所述α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶苷酶和木聚糖酶不同时添加。在本专利技术的一种实施方式中，所述α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的添加量为0.067U/mL麦芽汁，木聚糖酶的添加量为333U/mL麦芽汁。有益效果：应用本专利技术的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶苷酶可以使麦汁的过滤速度提高12.8％，粘度降低2.4％，浊度提高2.3％。随着重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的添加，麦汁中AX的含量增加了1.1％，PAX的含量减少了2.9％。PAX的降解可以降低麦汁的粘度，使麦汁的过滤速度提高12.8％。本专利技术将重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶苷酶应用于大麦麦芽阿拉伯木聚糖的降解中，当重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和木聚糖酶同时作用于木聚糖时协同能力为113％；当先加α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶再加木聚糖酶作用于木聚糖时协同能力为122％，当先加木聚糖酶再加α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶作用于木聚糖时协同能力124％。附图说明图1为重组表达质粒pPIZαA-QAnabfA的构本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基因工程菌，其特征在于，以毕赤酵母为宿主，以pPICZαA为载体，表达SEQ ID NO.1所示的α‑L‑阿拉伯呋喃糖苷酶。

【技术特征摘要】
1.一种基因工程菌，其特征在于，以毕赤酵母为宿主，以pPICZαA为载体，表达SEQIDNO.1所示的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶。2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，宿主为毕赤酵母X-33。3.一种构建权利要求1所述基因工程菌的方法，其特征在于，将SEQIDNO,2所示的编码α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的基因与pPICZαA连接，再转化至毕赤酵母中进行表达。4.一种制备重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶苷酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将SEQIDNO,2所示的编码α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的基因与pPICZαA连接，再整合到毕赤酵母的基因组上，得到重组菌株；(2)培养重组菌株，诱导重组α-L-阿拉伯...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭世平，张明，陆健，蔡国林，解西柱，潘贺鹏，
申请(专利权)人：江苏省农垦麦芽有限公司，江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32