筛选与G蛋白βγ二聚体相互作用蛋白质的酵母转化子及其筛选方法技术

本发明专利技术涉及一种筛选与G蛋白βγ二聚体相互作用蛋白质的酵母转化子及其筛选方法，该酵母转化子含有桑树β亚基和γ亚基的编码基因；将桑树cDNA文库转化至获得能同时表达β和γ亚基的酵母转化子中，最后利用His和Met两种营养缺陷筛选而得到与βγ二聚体相互作用的阳性克隆，最后成功筛选到与桑树G蛋白βγ二聚体互作的蛋白。该方法可高效筛选蛋白二聚体互作蛋白，并成功地应用于桑树G蛋白βγ二聚体互作蛋白的筛选。

Screening of yeast transformants for interacting proteins of G protein beta gamma two and their screening methods

The present invention relates to a yeast transformer for screening proteins interacting with G protein beta gamma dimer and a screening method thereof. The yeast transformer contains coding genes of mulberry beta subunit and gamma subunit; the mulberry cDNA library is transformed into a yeast transformer capable of simultaneously expressing both beta and gamma subunits; and finally two nutrient deficiencies, His and Met, are utilized. The positive clones interacting with beta-gamma dimer were obtained by trapping screening. Finally, the proteins interacting with mulberry G protein beta-gamma dimer were successfully screened. This method can be used to screen protein dimer interacting proteins efficiently, and has been successfully applied to screen protein G protein beta-gamma dimer interacting proteins in mulberry.

【技术实现步骤摘要】
筛选与G蛋白βγ二聚体相互作用蛋白质的酵母转化子及其筛选方法
本专利技术属于遗传生物
，涉及筛选与G蛋白βγ二聚体相互作用蛋白质的酵母转化子；还涉及筛选方法和应用。
技术介绍
蛋白质与蛋白质之间相互作用是指两个或两个以上的蛋白质分子通过非共价键形成蛋白质复合体而行使功能，该过程是构成细胞生化反应网络的一个主要组成部分。目前用于研究蛋白质相互作用的方法包括酵母双杂交系统、噬茵体展示技术、等离子共振技术、荧光能量转移技术、抗体与蛋白质阵列技术、免疫共沉淀技术和pull-down技术等。其中酵母双杂交系统是最为快速和直接的蛋白质互作研究的方法，其基本原理是：一个完整的酵母转录因子GAL4可分为功能上相互独立的两个结构域DNA结合域(DNA-BD)和转录激活域(AD)。正常条件下，BD不能与AD结合，将要检测的蛋白质分别与BD和AD融合，形成bait融合蛋白(bait-BD)和prey融合蛋白(prey-AD)，如果bait和prey发生相互作用，就会促使BD和AD的相互接近，形成完整的GAL4，从而激活报告基因的转录。酵母双杂交技术还应用于对目标蛋白的未知互作蛋白的大规模筛选中，相较于其它筛选方法，具有筛选量大、效率高及应用广泛等优点。在细胞中，有些蛋白不能单独行使功能，而是通过与其他蛋白质形成聚合体后才能与其下游蛋白结合，如三聚体G蛋白由α、β和γ亚基组成，在失活的情况下，三种亚基以三聚体的形式存在，不能传递信号，而当G蛋白被激活后，三聚体发生解离，其中β和γ亚基仍然保持着二聚体的形式行使功能。为筛选和鉴定βγ二聚体的下游信号元件，研究者通常是鉴定与β和γ亚基单独互作的蛋白，并不能完全反映βγ二聚体的功能。因此，开发一种筛选与蛋白二聚体相互作用的蛋白质的方法是比较迫切的需要。酵母三杂交技术由酵母双杂交技术开发而来，与酵母双杂交一样，也利用了转录激活子调控真核基因转录的特点。不同的是，酵母三杂交研究了两个蛋白与第三个成分之间的相互作用，第三个分子包含了蛋白质。目前还没有太多关于大规模筛选蛋白二聚体如βγ二聚体的互作蛋白的报道。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种筛选与G蛋白βγ二聚体相互作用蛋白质的酵母转化子；本专利技术的目的之二在于提供利用所述酵母转化自筛选与G蛋白βγ二聚体相互作用蛋白质的方法。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：1.筛选与G蛋白βγ二聚体相互作用蛋白质的酵母转化子，包括如下步骤：1)将桑树β亚基和γ亚基的编码基因分别插入到将pBridge载体的MCSI和MCSII，重组质粒pBridge-βγ；2)将步骤1)获得的重组质粒pBridge-βγ转化AH109酵母中，获得筛选与G蛋白βγ二聚体相互作用蛋白质的酵母转化子。优选的，所述γ亚基为γ1亚基或γ2亚基。2.利用所述酵母转化自筛选与G蛋白βγ二聚体相互作用蛋白质的方法，包括如下步骤：提取桑树RNA，反转合成cDNA，然后连接线性化的pGADT7载体，形成桑树文库质粒，然后将桑树文库质粒转入所述酵母转化子中，用SD-Trp-Leu-His-Met+5mM3AT筛选阳性克隆子，然后阳性克隆中提取质粒，转化大肠杆菌后测序、分析得到与G蛋白βγ二聚体相互作用蛋白质。优选的，所述桑树文库的文库库容大于3×106CFUml-1，平均插入片段大于1200bp，阳性率为100％。优选的，筛选阳性克隆的方法如下，将转入文库质粒的筛选与G蛋白βγ二聚体相互作用蛋白质的酵母转化子，涂于SD-Trp-Leu-His-Met和5mM3AT平板上，30℃恒温培养3～4天，在培养到第3天时，用无菌绒布对筛库平板进行影印清除后，继续培养20天，从筛库平板中挑取长出的阳性克隆单菌落，分别各挑取了初始阳性克隆转化子转接到SD-Trp-Leu-His-Met缺陷型平板中继续培养2～3天，最终获得了阳性克隆子。本专利技术的有益效果在于：本专利技术公开了筛选与G蛋白βγ二聚体相互作用蛋白质的酵母转化子，该转化子可基于酵母三杂交筛选与桑树G蛋白βγ二聚体相互作用蛋白质的方法，该方法简单易行，成功筛选到βγ二聚体互作的候选蛋白，为研究多种蛋白质的相互作用提供了技术支持。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：图1为总RNA的提取(A)、mRNA的分离(B)和酵母双杂交文库插入片段长度的结果(C)。图2为pBridge-βγ1和pBridge-βγ2自激活检测结果。图3为pBridge-Gβγ1筛选文库的转化效率。图4为Gβγ1筛库酵母转化子菌落对HIS3报告基因激活的检测。图5为Gβγ1筛库酵母转化子菌落对HIS3报告基因回转验证的检测。图6为pBridge-Gβγ2筛选文库的转化效率。图7为Gβγ2筛库酵母转化子菌落对HIS3报告基因激活的检测。图8为Gβγ2筛库酵母转化子菌落对HIS3报告基因回转验证的检测。具体实施方式下面将结合附图，对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。实施例1、筛选与G蛋白βγ1二聚体相互作用蛋白质的酵母转化子筛选与G蛋白βγ1二聚体相互作用蛋白质的酵母转化子构建方法，包括如下步骤：1)将桑树β亚基的编码基因(Genbank登录号：KX099865)插入到将pBridge载体的MCSI的EcoRI和SalI酶切位点之间，γ1亚基的编码基因(Genbank登录号：KX099866)插入到将pBridge载体的MCSII的NotI和BglII酶切位点之间，重组质粒pBridge-βγ1。2)将步骤1)获得的重组质粒pBridge-βγ1转化AH109酵母中，获得含pBridge-Gβγ1诱饵质粒的AH109酵母转化子。实施例2、酵母三杂交筛选与桑树βγ1相互作用蛋白质的方法酵母三杂交筛选与桑树βγ1相互作用蛋白质的方法，包括如下步骤：1)用质量分数0.6％NaCl处理15d苗龄的桑树幼苗，利用Trizol法提取及分离RNA(图1，A和B)，进行cDNA第一链和第二链合成，随后将其转到线性化的pGADT7载体上去，获得文库质粒，最后对其进行库容量的鉴定和插入片段大小鉴定(图1，C)，文库库容大于3×106CFUml-1，平均插入片段大于1200bp，阳性率为100％，文库指标合格；2)将其重组质粒pBridge-βγ1和pGADT7共转化AH109酵母中，随机挑取6个菌落进行自激活检测，进行HIS3报告基因的检测(图2)；同时pGADT7-LargeT和pGBKT7-p53作为阳性对照转入AH109酵母中，pGADT7-LargeT和pGBKT7-LaminC作为阴性对照转入AH109酵母中。结果显示，对照菌株在SD-Trp-Leu-Met缺陷平板上都能正常生长，而仅有阳性对照可在SD-Trp-Leu-His-Ade-Met缺陷平板生长；3)用含有正确pBridge-Gβγ1诱饵质粒的AH109酵母转化子作为受体菌制备感受态，将文库质粒转入其中，涂于SD-Trp-Leu-His-Met和5mM3AT(3-氨基-1,2,4-三氮唑)平板上，30℃恒温培养3～4天，观察转化结果(图3)，记录转化效率；为了消除背景生长菌落的干扰，在培养到第3天时，用无菌绒布对筛库平板进行影印清除后，继续培养7～14天。分批本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.筛选与G蛋白βγ二聚体相互作用蛋白质的酵母转化子，其特征在于，包括如下步骤：1)将桑树β亚基和γ亚基的编码基因分别插入到将pBridge载体的MCS I和MCS II，重组质粒pBridge‑βγ；2)将步骤1)获得的重组质粒pBridge‑βγ转化AH109酵母中，获得筛选与G蛋白βγ二聚体相互作用蛋白质的酵母转化子。

【技术特征摘要】
1.筛选与G蛋白βγ二聚体相互作用蛋白质的酵母转化子，其特征在于，包括如下步骤：1)将桑树β亚基和γ亚基的编码基因分别插入到将pBridge载体的MCSI和MCSII，重组质粒pBridge-βγ；2)将步骤1)获得的重组质粒pBridge-βγ转化AH109酵母中，获得筛选与G蛋白βγ二聚体相互作用蛋白质的酵母转化子。2.根据权利要求1所述筛选与G蛋白βγ二聚体相互作用蛋白质的酵母转化子，其特征在于：所述γ亚基为γ1亚基或γ2亚基。3.利用权利要求1或2所述酵母转化自筛选与G蛋白βγ二聚体相互作用蛋白质的方法，其特征在于，包括如下步骤：提取桑树RNA，反转合成cDNA，然后连接线性化的pGADT7载体，形成桑树文库质粒，然后将桑树文库质粒转入所述酵母转化子中，用SD-Trp-Leu-His-Met...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵爱春，刘长英，龙定沛，胡杰，向仲怀，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50