组成诱导型酵母工程菌及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种组成诱导型酵母工程菌及其构建方法。同时包含需要表达的蛋白基因的组成型表达盒和诱导型表达盒串联在一起导入酵母宿主细胞中，通过一次抗生素筛选即可获得同时组成型和诱导型表达所需蛋白的酵母基因工程菌，以表达β‑甘露聚糖酶为例，同单独组成型或诱导型表达β‑甘露聚糖酶的工程菌相比，β‑甘露聚糖酶发酵活力显著提高；该方法操作简单，可用于提高其它异源蛋白在酵母基因工程菌中的表达水平。

【技术实现步骤摘要】
组成诱导型酵母工程菌及其构建方法
本专利技术属于基因工程领域，本专利技术涉及可同时组成型和诱导型表达蛋白或多肽的酵母基因工程菌及其构建方法。
技术介绍
毕赤酵母表达系统被广泛用作于异源蛋白的表达，其中，由GAP启动子启动的组成型表达和AOX1启动子启动的诱导型表达应用最为广泛，而两者结合起来可大大提高异源蛋白的表达水平。通过广泛查阅国内外文献和专利发现，目前组成型和诱导型共表达的毕赤酵母基因工程菌的构建均是通过两次转化、两次筛选和双抗性筛选(J.M.Wu,etal.,EnzymeandMicrobialTechnology,33(4):453–459；XiupingHe,etal.,EnzymeandMicrobialTechnology,43(1):13-18；中国专利200910191241.8)。目前的方法费时、费力且价格昂贵，而本专利技术采用将组成型和诱导型表达盒串联起来通过一次转化和单抗性筛选即可获得相应的毕赤基因工程菌。β-甘露聚糖酶是一类水解β-1,4-D-甘露聚糖糖苷键的内切水解酶，属于半纤维素酶类。其可水解甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖等植物多糖。甘露聚糖在自然界中含量丰富，广泛存在于植物细胞中，如大豆、谷类种子、魔芋精粉、田青胶、角豆胶、澳大利亚蒲葵等(DhawanS.&KaurJ.,Criticalreviewsinbiotechnology,27(4):197-216)。β-甘露聚糖酶广泛应用于造纸、食品、医药、纺织、饲料和石油开采等领域，成为近年来研究的热点(vanZylW,etal.,ProcessBiochemistry,45(8):1203-1213)。目前，在微生物(细菌、放线菌和真菌)、植物和低等动物中均发现β-甘露聚糖酶的存在(ChauhanPS,etal.,Appliedmicrobiologyandbiotechnology,93:1817-1830)。真菌和细菌来源的β-甘露聚糖酶具有宽泛的温度和pH作用范围，催化活力高，活力稳定而具有显著的工业应用优势(Akino,etal.,Appl.MicrobialBiotech,26:323-327)。由于野生菌株发酵水平低，导致β-甘露聚糖酶价格昂贵，不能满足工业应用需求。近年来，国内外采用基因工程手段以提高β-甘露聚糖酶表达水平，如中国专利技术专利201110086452.2和201110410537.1，但将组成型和诱导型表达盒串联起来通过一次转化和单抗性筛选构建高效表达β-甘露聚糖酶的毕赤基因工程菌还未见报道。α-淀粉酶是一种内切葡萄糖苷酶，作用于淀粉糖链内部水解1,4-α-D-葡萄糖苷键以降低黏度起到液化作用。中温α-淀粉酶是一种重要的工业用酶，广泛用于食品、酿造、饲料、药品、纺织和日化用品等领域，市场需求量大。欧美国家着手该酶的研发较早，近年来采用分子育种技术不断进行生产菌株更新换代，发酵水平较高。我国进行中温α-淀粉酶的研发起步晚，多通过购买国外技术或采用传统育种技术获得生产菌株，现代分子定向育种技术未被充分利用，发酵水平落后于欧美国家。近年来，国内外采用基因工程手段以提高中温α-淀粉酶表达水平，如中国专利技术专利201110006353.9，但将组成型和诱导型表达盒串联起来通过一次转化和单抗性筛选构建高效表达中温α-淀粉酶的毕赤基因工程菌还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有组成型和诱导型共表达异源蛋白的毕赤酵母基因工程菌构建技术，需要两次转化、两次筛选和双抗性筛选的不足，提供一种通过一次转化和筛选即可获得组成型和诱导型共表达异源蛋白的毕赤酵母基因工程菌及其构建方法。组成诱导型酵母工程菌，是将含有需要表达的蛋白基因的组成型表达盒和诱导型表达盒串联在一起导入酵母宿主细胞中获得的酵母工程菌。所述的组成诱导型酵母工程菌：所述的组成型表达盒是包含三磷酸甘油醛脱氢酶启动子的表达盒，所述的诱导型表达盒是包含诱导型醇氧化酶启动子的表达盒，所述的酵母为毕赤酵母。所述的组成诱导型酵母工程菌：所述的需要表达的蛋白基因是能被毕赤酵母正确表达的蛋白基因，优选包括：β-甘露聚糖酶基因或中温α-淀粉酶。所述的组成诱导型酵母工程菌：β-甘露聚糖酶基因序列如SEQIDNo.1所示，中温α-淀粉酶基因序列如SEQIDNo.2所示。所述的组成诱导型酵母工程菌的构建方法，包括以下步骤：(1)将需要表达的蛋白基因序列克隆到包含三磷酸甘油醛脱氢酶启动子的质粒的多克隆位点中，得到组成型表达质粒；(2)将步骤(1)中所述的需要表达的蛋白基因序列克隆到包含诱导型醇氧化酶启动子质粒的多克隆位点中，得到诱导型表达质粒；(3)用限制性内切酶BamHI或BglП和能切割非表达盒区域的任一限制性内切酶线性化组成型表达质粒和诱导型表达质粒，所述的能切割非表达盒区域的任一限制性内切酶命名为X；在上述质粒的非表达盒区域内任一限制性内切酶位点都是唯一的；(4)回收两种质粒中含需要表达的蛋白基因的片段，连接两个片段，命名为组成诱导型质粒；(5)将上述组成诱导型质粒用限制性内切酶线性化后转化毕赤酵母菌株，通过平板筛选获得组成诱导型酵母工程菌。所述的组成诱导型酵母工程菌的构建方法，步骤(1)将需要表达的蛋白基因克隆到pGAPZαA/B/C的多克隆位点中，构建的质粒命名为pGAPZα-gene；步骤(2)将需要表达的蛋白基因克隆到pPICZZαA/B/C或pPICZ6αA/B/C的多克隆位点中，构建的质粒命名为pPICZα-gene。步骤(3)用限制性内切酶BamHI或BglП和能切割非表达盒区域的任一限制性内切酶X线性化pGAPZα-gene和pPICZα-gene。步骤(4)回收BamHI、X线性化pGAPZα-gene中含需要表达的蛋白基因的片段和BglП、X线性化pPICZα-gene中含需要表达的蛋白基因的片段，连接以上两个片段，命名为pGAPZα-gene-pPICZα-gene；或回收BglП、X线性化pGAPα-gene中含需要表达的蛋白基因的片段和BamHI、X线性化pPICZα-gene中含需要表达的蛋白基因的片段，连接以上两个片段，也命名为pGAPZα-gene-pPICZα-gene。当克隆的基因为β-甘露聚糖酶基因时，质粒pGAPZα-gene为pGAPZα-man，质粒pPICZα-gene为pPICZα-man，pGAPZα-gene-pPICZα-gene为pGAPZα-man-pPICZα-man，当克隆的基因为中温α-淀粉酶时，质粒pGAPZα-gene为pGAPZα-amy，质粒pPICZα-gene为pPICZα-amy，pGAPZα-gene-pPICZα-gene为pGAPZα-amy-pPICZα-amy。步骤(5)将组成诱导型质粒用任一位于GAP启动子或AOX1启动子序列内的限制性内切酶线性化后转化毕赤酵母菌株，通过含Zeocin或Blasticidin的平板筛选获得表达β-甘露聚糖酶的酵母基因工程菌株。现有技术中进行双基因片段的连接时，一般是直接将一个质粒用BglII和BamHI进行双酶切获得片段A，另一个质粒用BamHI进行单酶切获得片段B，然后回收相应片段进行连接，此外BamHI单酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.组成诱导型酵母工程菌，其特征在于：是将含有需要表达的蛋白基因的组成型表达盒和诱导型表达盒串联在一起导入酵母宿主细胞中获得的酵母工程菌。

【技术特征摘要】
1.组成诱导型酵母工程菌，其特征在于：是将含有需要表达的蛋白基因的组成型表达盒和诱导型表达盒串联在一起导入酵母宿主细胞中获得的酵母工程菌。2.根据权利要求1所述的组成诱导型酵母工程菌，其特征在于：所述的组成型表达盒是包含三磷酸甘油醛脱氢酶启动子的表达盒，所述的诱导型表达盒是包含诱导型醇氧化酶启动子的表达盒，所述的酵母为毕赤酵母。3.根据权利要求1所述的组成诱导型酵母工程菌，其特征在于：所述的需要表达的蛋白基因是能被毕赤酵母正确表达的蛋白基因，优选包括：β-甘露聚糖酶基因或中温α-淀粉酶。4.根据权利要求1所述的组成诱导型酵母工程菌，其特征在于：β-甘露聚糖酶基因序列如SEQIDNo.1所示，中温α-淀粉酶基因序列如SEQIDNo.2所示。5.权利要求1-4任一项所述的组成诱导型酵母工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将需要表达的蛋白基因序列克隆到包含三磷酸甘油醛脱氢酶启动子的质粒的多克隆位点中，得到组成型表达质粒；(2)将步骤(1)中所述的需要表达的蛋白基因序列克隆到包含诱导型醇氧化酶启动子质粒的多克隆位点中，得到诱导型表达质粒；(3)用限制性内切酶BamHI或BglП和能切割非表达盒区域的任一限制性内切酶线性化组成型表达质粒和诱导型表达质粒，所述的能切割非表达盒区域的任一限制性内切酶命名为X；(4)回收两种质粒中含需要表达的蛋白基因的片段，连接两个片段，命名为组成诱导型质粒；(5)将上述组成诱导型质粒用限制性内切酶线性化后转化毕赤酵母菌株，通过平板筛选获得组成诱导型酵母工程菌。6.根据权利要求5所述的组成诱导型酵母工程菌的构建方法，其特征在于，步骤(1)将需要表达的蛋白基因克隆到pGAPZαA/B/C的多克隆位点中，构建的质粒命名为pGAPZα-gene；步骤(2)将需要表达的蛋白基因克隆到pPICZZαA/B/C或pPICZ6αA/...

【专利技术属性】
技术研发人员：周洪波，唐诗哲，郑甲，程海娜，徐挺亮，周凯燕，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43