一种用于高糖发酵的己糖转运蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于高糖发酵的己糖转运蛋白及其应用，属于基因工程技术领域。本发明专利技术公开了一种来源于产甘油假丝酵母Candida glycerolgenesis CGMCC NO.15118的己糖转运蛋白基因CgHXT4，在Sacharomyces cerevisiae中过表达该基因，可显著提高S.cerevisiae的生物量、耗糖速率和乙醇产量。重组菌株在高浓度葡萄糖(250g/L)外界环境下具有较明显的生长和优势，在发酵结束时，重组菌株的生长量提高了7.7％，耗糖速率提高了18％，乙醇产量提高了24％。

【技术实现步骤摘要】
一种用于高糖发酵的己糖转运蛋白及其应用
本专利技术涉及一种用于高糖发酵的己糖转运蛋白及其应用，属于基因工程

技术介绍
己糖是一类含六个碳原子的多羟基化合物，包括葡萄糖、果糖、甘露糖和半乳糖等，其大量存在于自然环境中，是生物发酵产业中应用最为广泛的一类碳源。酵母因其发酵特性良好，能将糖发酵转化为乙醇、甘油和有机酸等多种产物，已经作为菌种大量应用于发酵生产。在酵母中，糖从胞外进入细胞的过程由己糖转运蛋白负责。己糖转运蛋白具备不同的转运活性和调控模式，为应对变化多样的生理环境而发挥作用。然而，糖分子跨膜转运至胞内的过程是酵母发酵代谢的限速步骤，特别是在高浓度葡萄糖条件下，菌株的生理活性受到严重抑制，从而影响了发酵生产的经济效益。提高糖转运效率特别应用高效的己糖转运蛋白能够促进细胞快速适应浓醪发酵条件，使得工业发酵生产的过程更加高效。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种己糖转运蛋白在提高酿酒酵母生物量、耗糖速率和产品产量中至少一个方面的应用。在本专利技术的一种实施方式中，所述己糖转运蛋白来源于产甘油假丝酵母(Candidaglycerolgenesis)CGMCCNo.15118。在本专利技术的一种实施方式中，所述己糖转运蛋白含有SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。在本专利技术的一种实施方式中，所述己糖转运蛋白来源于产甘油假丝酵母(Candidaglycerolgenesis)CGMCCNo.15118。本专利技术的第二个目的是提供一种重组酿酒酵母，过表达来源于产甘油假丝酵母的己糖转运蛋白基因CgHXT4。在本专利技术的一种实施方式中，所述产甘油假丝酵母为产甘油假丝酵母(Candidaglycerolgenesis)CGMCCNo.15118。在本专利技术的一种实施方式中，以尿嘧啶营养缺陷型酿酒酵母BY4743为宿主细胞。在本专利技术的一种实施方式中，以pYX212作为其游离表达载体。本专利技术的第三个目的是提供构建所述重组酿酒酵母的方法，所述方法先克隆C.glycerolgenesisCGMCCNO.15118中的己糖转运蛋白基因CgHXT4，以pYX212作为其游离表达载体，在尿嘧啶营养缺陷型酿酒酵母BY4743中过表达CgHXT4基因。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法的具体操作步骤包括：步骤1：以C.glycerolgenesisCGMCCNO.15118基因组为模板，利用上下游引物CgHXT4F(SEQIDNo.3)和CgHXT4R(SEQIDNo.4)PCR扩增CgHXT4基因；步骤2：利用限制性酶切位点将CgHXT4基因片段插入到S.cerevisiae过表达游离载体pYX212的多克隆位点上，以TPI组成型强启动子控制其表达，获得重组载体pYX212-CgHXT4。该载体筛选标记为尿嘧啶合成基因URA3，复制起点为2μ；步骤3：重组载体通过醋酸锂(LiAc)转化法将其导入尿嘧啶营养缺陷型酿酒酵母S.cerevisiaeBY4743细胞中。经YNB平板筛选，获得单菌落，通过提取单菌落全DNA进行PCR验证，获得过表达CgHXT4基因的酿酒酵母重组菌株；本专利技术的第四个目的是提供一种提高乙醇发酵产量的方法，所述方法以所述重组酿酒酵母为发酵微生物，利用含葡萄糖的原料为底物发酵生产乙醇。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵是在28～30℃，发酵25～48h。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵是在含葡萄糖的培养基中发酵。本专利技术还提供所述重组酿酒酵母在食品、生物、医药领域制备含酒精的产品方面的应用。有益效果：本专利技术通过过表达C.glycerolgenesisCGMCCNO.15118己糖转运蛋白基因CgHXT4，使得S.cerevisiaeBY4743重组菌株发酵32h后的生物量、耗糖速率和乙醇产量分别提高了7.7％、18％和24％。附图说明图1是验证C.glycerolgenesisCGMCCNO.15118己糖转运蛋白基因CgHXT4克隆成功的凝胶电泳图；图2是重组载体pYX212-CgHXT4的示意图；图3是过表达CgHXT4的S.cerevisiaeBY4743重组菌株摇瓶发酵生产乙醇结果；实验经过三次以上重复。生物材料保藏一株产甘油假丝酵母(Candidaglycerolgenesis)，已于2017年12月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.15118，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。具体实施方式实施例1重组载体pYX212-CgHXT4的构建以C.glycerolgenesisCGMCCNO.15118基因组为模板，利用上下游引物CgHXT4F和CgHXT4R(引物由上海生工生物工程有限公司合成)，PCR扩增CgHXT4基因(PCR聚合酶ExTaq购自TaKaRa公司)。PCR扩增产物采用SanPrcp柱式PCR产物纯化试剂盒回收(上海生工生物工程有限公司)。扩增结果如图1所示，获得大小为1560bp的基因片段。扩增片段用T4DNA连接酶连接T-VectorpMD19simple(DNA连接酶和T-Vector均购自TaKaRa公司)，送至上海生工测序。测序正确后将CgHXT4片段和酿酒酵母游离表达载体pYX212用BamHI和SalI双酶切(核酸内切酶购自TaKaRa公司)，连接获得重组载体pYX212-CgHXT4。实施例2挑取一环尿嘧啶营养缺陷型酿酒酵母BY4743菌株接种至液体YPD培养基中，30℃过夜培养。取100μl过夜培养的菌液转接至新的YPD液体培养基中，30℃培养至OD600达到1.3左右，离心收集菌体。重组载体pYX212-CgHXT4用醋酸锂转化法将其转入尿嘧啶营养缺陷型酿酒酵母BY4743感受态细胞中，涂布YNB培养基(葡萄糖20g/L，YNB6.7g/L，补充20mg/L组氨酸、亮氨酸、赖氨酸和蛋氨酸)，30℃培养2-3天获得单菌落。挑取单菌落提取全细胞DNA进行PCR验证，获得正确的重组菌株。实施例3分别挑取一环空载对照菌株和重组菌株接入种子培养基(酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，余量为水)中，在30℃，200r/min条件下，振荡培养18h，得到液态种子。将得到的液态种子按1％(v/v)的接种量接入含有50mL发酵培养基(酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖250g/L，余量为水)的250mL锥形瓶中，控制发酵温度为30℃，转速为200r/min，时间为40h，发酵结束。采用高效液相色谱法(HPLC)测定发酵液中葡萄糖和乙醇含量，具体如下：将发酵液进行离心，10,000r/min，离心后用再用0.22μm微孔滤膜过滤处理，测量设备采用高效液相色谱仪(Agilent，USA)，色谱柱为AminexHPX-87C糖分析柱(300×7.8mm；Aminex，美国)，流动相为5mmol/LH2SO4水溶液，流动相流速0.6mL/min，柱温60℃，进样10μL，使用示差检测器检测(ShodexRI-101,Dionex,日本)。发酵过程中对菌株的生长情况、葡萄糖残余量和乙醇产量进行检测。结果如图3所示，与空载对照菌株相比，发酵32h时，重组菌株的生物量提高了7.7％，葡萄糖消耗速率提升了18％，乙醇本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组酿酒酵母，其特征在于，过表达来源于产甘油假丝酵母的己糖转运蛋白；所述产甘油假丝酵母为产甘油假丝酵母(Candida glycerolgenesis)CGMCC No.15118。

【技术特征摘要】
1.一种重组酿酒酵母，其特征在于，过表达来源于产甘油假丝酵母的己糖转运蛋白；所述产甘油假丝酵母为产甘油假丝酵母(Candidaglycerolgenesis)CGMCCNo.15118。2.根据权利要求1所述的重组酿酒酵母，其特征在于，所述己糖转运蛋白含有SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。3.根据权利要求1或2所述的重组酿酒酵母，其特征在于，以尿嘧啶营养缺陷型酿酒酵母BY4743为宿主细胞，和/或以pYX212作为游离表达载体。4.一种己糖转运蛋白在提高酿酒酵母生物量、耗糖速率和产品产量中至少一个方面的应用；所述己糖转运蛋白含有SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。5.一种构建权利要求1～3任一所述重组酿酒酵母的方法，其特征在于，将C.glycero...

【专利技术属性】
技术研发人员：诸葛斌，徐嫣艺，梁展斌，陆信曜，宗红，宋健，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32