一种青蒿PDR亚家族转运蛋白及其功能验证方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种青蒿PDR亚家族转运蛋白，该蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或者如SEQ ID NO:2所示；或者该蛋白由在高严谨条件与编码氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示的蛋白质的核酸的互补链杂交的核酸编码。进一步地，发明专利技术人将该蛋白命名为AaPDR1，为青蒿分泌型腺毛特异表达的转运蛋白，酵母转运实验和青蒿中干扰该转运蛋白证明AaPDR1参与青蒿中青蒿素合成途径中间产物二氢青蒿酸的转运。该发明专利技术对于为青蒿素的规模化生产提供高产、稳定新药源具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程
，具体设及一种青葛PDR亚家族转运蛋白及其功能 验证方法和应用。
技术介绍
青葛(Artemisia annua L.)是菊科葛属的一年生草本植物。其地上部分所提取的 含有过氧桥的倍半祗内醋氧化物一一青葛素，是目前应用最广泛，疗效最好的抗追疾药物， 特别是对脑型追疾和抗氯哇追疾更加有效。目前，青葛素联合疗法(ACTS)是世界卫生组织 推荐的最有效的治疗追疾的方法。但其青葛素在植物青葛中的含量低，尚无法完全满足全 球的市场需求。青葛具有分泌型腺毛（g 1 andu 1 ar tr i chome S )和非分泌型腺毛 (nonglanduladrichomes)。在青葛叶片的正面和背面、茎杆、花上都大量存在分泌型腺毛， 运里是大量次生代谢物的累积场所，青葛素也被认为储存于此处。 ATP结合盒式(ATP binding cassette,ABC)转运蛋白是一大类非常多样化非常特 殊的超级家族。大部分ABC转运蛋白直接参与到各种分子的跨膜运输。此转运蛋白利用水解 ATP释放能量对细胞质内多种生物分子进行跨膜运输，转运底物包括:脂类、氨基酸、生物 碱、祗类物质等。根据对于细胞质的转运方向可W粗略分为摄取转运蛋白（importer)和外 排转运蛋白（exporter) dABC转运蛋白的特征是具有ATP结合区域（ATP-binding cassette)，也被称为核酸结合区域(nucleotide-binding domain，NBD)，具有一些非常保 守的模序（motif),包括Walker A和Walker B序列、ABC signature motif、H loop和Q loop。植物中有大量的ABC转运蛋白，近年来的研究表明植物ABC转运蛋白不仅仅设及到植 物激素、醋类、金属离子、次生代谢物、外源化学物质的转运有关，而且对于植物和病原体互 作W及离子通道的建成都有重要作用。多向耐药性(pleiohopic drug resistance，PDR) 转运蛋白属于ABC转运蛋白家族G亚家族，包含反向的核酸结合区域-跨膜结合区域(NW- TMD)类型的转运蛋白。
技术实现思路
针对青葛素在植物青葛中的含量低，无法有效满足市场需求的问题，专利技术人考虑 到如果通过对青葛分泌型腺毛转录组数据库分析，筛选出参与青葛素合成途径相关转运蛋 白，并且验证其功能，那么就可W利用基因工程手段提高转运蛋白的转运效率，从而提高青 葛中青葛素的含量。AaPDRl是专利技术人从青葛中克隆得到的一种ABC转运蛋白，属于青葛PDR 转运蛋白亚家族，因此是一种青葛PDR亚家族转运蛋白，命名为AaPDRl。为了验证AaPDRl的 功能，专利技术人利用酵母突变体AD12345678体外转运实验证明AaPDRl是青葛素直接前体物质 二氨青葛酸的从胞内到胞外的外排转运蛋白。并且采用基因工程手段，将该AaPDRl转运蛋 白反义干扰载体转化青葛，可W显著抑制青葛素的合成。因此，克隆AaPDRl基因及其外排功 能的研究对于提高青葛素含量和生产代谢产物的基因工程育种具有重要意义。经对现有技 术文献的检索发现，尚未发现有与本专利技术的AaPDRl基因序列相关的报道。 本专利技术提供一种青葛PDR亚家族转运蛋白，所述青葛PDR亚家族转运蛋白具有w下 一种或者两种特征： 1)所述青葛PDR亚家族转运蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID N0:2所示的氨基酸序 列;或者所述青葛PDR亚家族转运蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示； 2)所述青葛PDR亚家族转运蛋白由在高严谨条件与编码氨基酸序列为SEQ ID NO: 2所示的蛋白质的核酸的互补链杂交的核酸编码。[000引进一步地，所述青葛PDR亚家族转运蛋白由如SEQ ID NO: 1所示的核酸编码。 进一步地，所述青葛PDR亚家族转运蛋白存在于植物青葛(Ademisia annua L.) 中，所述青葛PDR亚家族转运蛋白具有转运二氨青葛酸的功能。"高严谨条件"的核酸杂交一 般是指本领域技术人员认可的低盐、高溫条件下的核酸杂交，是本领域的公知常识。 本专利技术实际上是提供了一种多肤或者一种蛋白质，该多肤或者蛋白质的氨基酸序 列如沈Q ID NO:2所示。 本专利技术还提供如上所述的青葛PDR亚家族转运蛋白的功能验证方法，包括W下步 骤： (1)从青葛cDNA文库中克隆到所述青葛PDR亚家族转运蛋白的核酸序列，如SEQ ID N0:1所示，即AaPDRl基因； (2)把AaPDRl基因可操作性地连接于酵母表达调控序列，形成含AaPDRl基因的酵 母表达载体； (3)将含所述AaPDRl基因的酵母表达载体转入酵母菌AD12345678,得到转基因酵 母菌，所述转基因酵母菌获得了二氨青葛酸外排的功能，从而验证了所述青葛PDR亚家族转 运蛋白具有外排二氨青葛酸的功能。 本专利技术还提供验证如上所述的青葛PDR亚家族转运蛋白功能的另一种方法，包括 W下步骤： (1)从青葛cDNA文库中克隆到所述青葛PDR亚家族转运蛋白的核酸序列，如SEQ ID NO :1所示，即AaPDRl基因； (2)把AaPDRl基因可操作性地连接于表达调控序列，形成含AaPDRl基因的植物反 义干扰表达载体； (3)将含所述AaPDRl基因的植物反义干扰表达载体转化根癌农杆菌邸105,获得具 有所述干扰表达载体的根癌农杆菌菌株； (4)利用所述步骤3构建的根癌农杆菌菌株转化青葛，经卡那霉素筛选得到抗性 苗，再经PCR检测为阳性的植株即为转基因青葛； (5)对获得的所述转基因青葛进行青葛素、二氨青葛酸和青葛酸含量测定，进而获 得青葛素合成受抑制的青葛植株，从而验证了所述青葛PDR亚家族转运蛋白具有影响青葛 素合成的功能。 进一步地，可W将上面两种验证方法合并，即包括W下步骤： (1)从青葛cDNA文库中克隆到所述青葛PDR亚家族转运蛋白的核酸序列，如SEQ ID NO :1所示，即AaPDRl基因； (2)把AaPDRl基因可操作性地连接于酵母表达调控序列，形成含AaPDRl基因的酵 母表达载体； (3)将含所述AaPDRl基因的酵母表达载体转入酵母菌AD12345678,得到转基因酵 母菌，所述转基因酵母菌获得了二氨青葛酸外排的功能，从而验证了所述青葛PDR亚家族转 运蛋白具有外排二氨青葛酸的功能； (4)把AaPDRl基因可操作性地连接于表达调控序列，形成含AaPDRl基因的植物反 义干扰表达载体； (5)将含所述AaPDRl基因的植物反义干扰表达载体转化根癌农杆菌邸105,获得具 有所述干扰表达载体的根癌农杆菌菌株； (6)利用所述步骤5构建的根癌农杆菌菌株转化青葛，经卡那霉素筛选得到抗性 苗，再经PCR检测为阳性的植株即为转基因青葛； (7)对获得的所述转基因青葛进行青葛素、二氨青葛酸和青葛酸含量测定，进而获 得青葛素合成受抑制的青葛植株，从而验证了所述青葛PDR亚家族转运蛋白具有影响青葛 素合成的功能。 优选地，采用引物AaPDRl-FPl (女曰SEQ ID N0:3所示）： AAACCCTTTTTGCTTTCTAATTGATTCA 和 AaPDRl-RPl (女日 SEQ ID N0:4 所示）： TTATC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种青蒿PDR亚家族转运蛋白，其特征在于，所述青蒿PDR亚家族转运蛋白具有以下一种或者两种特征：1)所述青蒿PDR亚家族转运蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或者所述青蒿PDR亚家族转运蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；2)所述青蒿PDR亚家族转运蛋白由在高严谨条件与编码氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示的蛋白质的核酸的互补链杂交的核酸编码。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：唐克轩，付雪晴，石璞，刘萌，陈明慧，马亚男，郝小龙，黎凌，刘品，孙小芬，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31