来自成体干细胞的诱导型起搏细胞和浦肯野细胞制造技术

通过SHOX2>TBX5>HCN2的顺序激活，将成体干细胞重新编程以形成起搏细胞和浦肯野细胞。这些浦肯野细胞自发地围绕更大的起搏细胞并与这些起搏细胞连接，从而形成诱导型窦房体，所述诱导型窦房体产生趣味电流并且可以以类似于自然窦房结的方式使心血管组织搏动。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】来自成体干细胞的诱导型起搏细胞和浦肯野细胞先前相关申请本申请涉及于2015年12月28日提交的U.S.14/980,274“InducedPacemakerandPurkinjeCellsfromAdultStemCells”，其全部内容出于所有目的并入本文。公开领域本专利技术涉及用于产生用于治疗心律失常的非收缩的、电活性的诱导心肌细胞的方法，以及用于增强心脏电活动的细胞的诱导产生和形成，例如由此产生并用于此目的的心脏的窦或窦房结细胞和浦肯野细胞。
技术介绍
心脏(图1A)是将血液泵送通过循环系统的血管的肌肉器官。在由右心房和左心房以及右心室和左心室组成的健康的哺乳动物心脏中，因为心脏瓣膜防止回流，所以血液仅一个方向流经心脏。心脏被包围在保护囊，心包中，其也包含少量液体。心脏壁由三层组成：心外膜、心肌和心内膜。窦房结(sinoatrialnode)(通常缩写为SA结或SAN；通常也称为窦房结(sinusnode)，不太常见的是窦房结(sinuatrialnode))是心脏的起搏点，并负责心跳的起始。它位于上腔静脉和心房的交界处，尺寸约为5毫米×2厘米。它自发地产生一个电脉冲，在整个心脏传导之后，导致心脏收缩。虽然电脉冲是自发产生的，但脉冲的速率(以及因此的心率)由支配位于心脏的右心房(上腔室)中的窦房结的神经来修改。房室(AV)结是协调心腔收缩的心脏电传导系统的一部分。它将心房和心室电性连接(图1B)。AV结是心房和心室之间的专门组织区域，特别是在冠状窦开口附近的房间隔的后下部区域，其将正常电脉冲从心房传导到心室。AV结相当紧凑(约1x3x5毫米)。它位于科赫三角形的中心-由三尖瓣隔膜瓣、冠状窦和房间隔的膜部分包围的三角形。AV结的远端部分被称为希氏束。希氏束在室间隔中分裂成两个分支，左束支和右束支。左束支激活左心室，右束支激活右心室。两个束状分支逐渐缩小以产生许多浦肯野纤维，这些纤维刺激个别心肌细胞群收缩。趣味电流(或趣味通道，或If或IKf，或起搏电流)是指心脏中的特定电流。在20世纪70年代后期首次在浦肯野纤维和窦房结肌细胞中描述，心脏起搏“趣味”电流已被广泛表征，并且其在心脏起搏中的作用已被研究。趣味电流在自发活动的心脏区域高度表达，如窦房结、房室结和传导组织的浦肯野纤维。趣味电流是一种混合钠-钾电流，其在舒张压范围(通常从-60/-70mV到-40mV)的电压下超极化时激活。当在窦房结动作电位结束时，膜在低于If阈值(大约-40/-50mV)时复极化，趣味电流被激活并且提供向内电流，其负责开始舒张性除极相(DD)。通过这种机制，趣味电流控制窦房肌细胞的自发活动率，从而控制心率。起搏电流的分子决定因素属于超极化激活的环核苷酸门控通道家族(HCN)，其中4种亚型(HCN1-4)迄今已知。基于它们的序列，HCN通道被分类为电压门控K+(Kv)和环核苷酸门控(CNG)离子通道超家族的成员。简而言之，控制心跳的电信号可以描述如下。电脉冲开始于SA结。电活动通过心房的壁传播并导致它们收缩。这迫使血液进入心室。AV结的功能就像是一个能够在电信号进入心室之前减缓电信号的门。这种延迟使心房有时间在心室之前收缩。经过这段延迟时间后，刺激发散，并通过左右希氏束传导至心脏各侧的相应浦肯野纤维，以及心脏心尖处的心内膜，最后传导至心室外膜。希氏-浦肯野纤维网络将脉冲发送到心室的肌肉壁并使其收缩。这迫使血液从心脏流向肺部和身体。SA结触发另一个脉冲，循环再次开始。心脏会出现许多问题而导致不规律的跳动。病窦综合征-也称为窦房结疾病或窦房结功能障碍-是一组心脏节律问题(心律失常)的名称，其中窦房结-心脏的自然起搏点-无法正常工作。人造心脏起搏器是一种医疗设备，它使用由使心脏肌肉去极化的电极来传递的电脉冲来调节心脏的跳动。人造心脏起搏器的主要目的是保持充足的心率，或者是因为心脏的自然起搏点不够快，或者是因为心脏的电传导系统存在阻塞。现代起搏器可以在外部进行编程，并允许心脏病专家为个别患者选择最佳起搏模式。有些将起搏器和除颤器结合在一个植入式设备中。其他具有刺激心脏内不同位置的多个电极以改善心脏的较高(心房)和较低心腔(心室)的同步。虽然人造起搏器挽救了许多生命，但它们并不是完美的解决方案。特别是，它们不具有激素响应性，会受到机械和/或电气故障，需要更换，电池并且可能在强磁场或治疗性辐射环境中被破坏。此外，感染始终是危险因素，心脏起搏器介导的心动过速、次优房室(AV)同步以及其他几种类型的起搏器诱发的心律失常也是危险因素。因此，目前正在努力开发更自然的起搏器。生物起搏器通常用作能够在静默组织中诱导自发活动的细胞底物，这是一种克服电子起搏器限制的潜在工具。开发自然起搏器以代替人造心脏起搏器的努力通常采取两种方法之一。一种方法是通过遗传操作(即直接重编程)将搏动心肌转换成起搏细胞。在这方面，早期关键转录因子TBX3提供了有希望的结果，但是产生具有不完整起搏特征的细胞。另一种方法是使用已编程形成起搏细胞的胚胎或诱导多能干细胞(所谓的IPS细胞)，然后用这些新编程的AV样细胞替换或补充AV细胞。在一项研究中，Jung等人试图通过诱导多能干细胞(iPSC)中的TBX3的上调来产生起搏细胞。Hashem等人(2013)指出SHOX2调节拟胚体中的起搏点基因程序。Bakker等人(2012)试图通过上调TBX3将终末分化的心肌细胞重编程为起搏细胞。在另一项研究中，Kapoor等人(2013)试图通过在成人心肌细胞中过表达TBX18来产生起搏细胞。Hu等人(2014)试图通过上调Tbx18将心肌细胞转化为起搏细胞。尽管过去曾多次试图产生心脏起搏细胞，但迄今为止还没有来自未分化的成体自体干细胞的正确的功能性生物起搏细胞可用于临床应用。以前只证明胚胎细胞或IPS细胞等细胞可以通过操纵某些基因来诱导以获得一些特征，这些特征存在于起搏点或心脏传导系统的其他细胞中。单独一个转录因子的表达不能开启转换为起搏或浦肯野细胞的完整的相应调控分化途径。过去产生起搏细胞的尝试未能模拟自然心脏起搏细胞的适当生理功能和形态特性。本文所述的工作使该研究进入新的和更高的状态：诱导来自患者自身组织的成人未修饰的新鲜未培养细胞(本文也称再生细胞)分化成具有自然起搏和浦肯野细胞的形态和功能结构和特征的非收缩性心肌细胞，这一成果以前尚未实现。专利技术概述本文描述了诱导起搏细胞、浦肯野细胞和由其缔合产生的窦房体，以及制造和使用它们的方法。使用基于慢病毒和基于mRNA的转染方法，脂肪来源干细胞(ADSC)已经通过各自连续应用包括SHOX2、TBX3、TBX5、TBX18和HCN2的转录因子的组合而重新编程为心脏起搏细胞。SHOX2是SA结中的NKX2.5的负性调节因子，其抑制收缩性心肌细胞分化途径，但是通过上调起搏点分化途径来特异性地将原始的相应祖细胞朝向非收缩性心肌细胞起搏细胞谱系引导。TBX3、TBX5和TBX18是调节原始中胚层来源的干细胞向起搏细胞谱系分化和SAN形成的主要转录因子。在组织发育晚期阶段，成熟起搏细胞不同于常见心肌细胞，因为存在自发性去极化过程，这是由不稳定的第4阶段电位引起的，其在心动周期的舒张阶段期间逐渐降低膜电位。当降低达到临界阈值时，钠通道打开并引起动本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种诱导成体再生细胞分化为诱导型非收缩性心肌细胞的方法，所述方法包括使成体再生细胞群体经历SHOX2>TBX5>HCN2的顺序表达以诱导所述细胞的特异性分化，并且培养所述细胞直至心脏起搏细胞和浦肯野细胞形成。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.12.28 US 14/980,2741.一种诱导成体再生细胞分化为诱导型非收缩性心肌细胞的方法，所述方法包括使成体再生细胞群体经历SHOX2>TBX5>HCN2的顺序表达以诱导所述细胞的特异性分化，并且培养所述细胞直至心脏起搏细胞和浦肯野细胞形成。2.如权利要求1所述的方法，其中所述再生细胞包含成体干细胞。3.如权利要求1所述的方法，其中所述再生细胞包含自体脂肪组织来源的干细胞。4.如权利要求1所述的方法，其包括诱导将编码SHOX2>TBX5>HCN2的DNA或mRNA顺序转染到所述细胞中。5.如权利要求1所述的方法，其包括诱导SHOX2>TBX5>TBX3>TBX18>HCN2的顺序表达。6.如权利要求1所述的方法，其中所述非收缩性心肌细胞由自体脂肪组织来源的再生细胞产生。7.如权利要求1所述的方法，其中所述诱导步骤使用编码SHOX2、TBX5和HCN2的一种或多种表达载体。8.如权利要求1所述的方法，其中所述诱导步骤使用编码SHOX2、TBX3、TBX5、TBX18和HCN2的一种或多种表达载体。9.如权利要求1所述的方法，其中所述诱导步骤使用编码SHOX2、TBX5和HCN2的一种或多种慢病毒载体。10.如权利要求1所述的方法，其中所述诱导步骤使用编码SHOX2、TBX3、TBX5、TBX18和HCN2的一种或多种慢病毒表达载体。11.如权利要求1所述的方法，其中所述诱导步骤使用编码SHOX2、TBX5和HCN2的mRNA。12.如权利要求1所述的方法，其中所述诱导步骤使用编码SHOX2、TBX3、TBX5、TBX18和HCN2的mRNA。13.如权利要求1所述的方法，还包括使所述起搏细胞和所述浦肯野细胞生长直至形成诱导型窦房体。14.一种组合物，其包含在药学上可接受的缓冲剂和/或细胞支持培养基中的通过如权利要求13所述的方法来制备的诱导型窦房体。15.一种组合物，其包含在药学上可接受的缓冲剂和/或细胞支持培养基中的通过如权利要求1所述的方法来制备的诱导型起搏细胞。16.一种组合物，其包含在药学上可接受的缓冲剂和/或细胞支持培养基中的通过如权利要求1所述的方法来制备的诱导型浦肯野细胞。17.一种组合物，其包含由成体再生细胞形成的重编程细胞群体，所述成体再生细胞用表达构建体来转化，所述表达构建体允许SHOX2>TBX5>HCN2的顺序表达，从而形成所述重编程细胞，所述重编程细胞群体在药学上可接受的液体赋形剂和/或细胞支持培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：E·阿尔特，T·卡里米，
申请(专利权)人：因泽恩公司，心血管研究人员联盟，
类型：发明
国别省市：美国,US