一种橙皮苷的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种橙皮苷的制备方法，包括如下步骤：(1)构建1,6‑鼠李糖基转移酶基因的表达载体；(2)将步骤(1)中所构建的表达载体利用农杆菌介导的遗传转化方法转入到愈伤组织中；(3)向步骤(2)所得的愈伤组织中加入橙皮素底物进行悬浮培养；(4)收集步骤(3)中所得悬浮细胞进行冷冻干燥后，并将所得干燥物溶于80％甲醇中混匀并进行离心，得到橙皮苷。本发明专利技术采用上述方法，利用工程细胞以橙皮素作为底物不断的合成橙皮苷，其效率高，且分离纯化简单，同时能耗低，产物的纯度高。

Preparation of hesperidin

The invention discloses a preparation method of hesperidin, which comprises the following steps: (1) constructing an expression vector of rhamnosyltransferase gene; (2) transferring the expression vector constructed in step (1) into callus by Agrobacterium-mediated genetic transformation; (3) adding hesperidin to the callus obtained in step (2). Substrate suspension culture; (4) Collection step (3) After freeze-drying, the suspension cells were dissolved in 80% methanol and mixed and centrifuged to obtain hesperidin. The invention adopts the above method and utilizes engineering cells to synthesize hesperidin continuously with hesperidin as the substrate. The method has high efficiency, simple separation and purification, low energy consumption and high purity of the product.

【技术实现步骤摘要】
一种橙皮苷的制备方法
本专利技术涉及一种橙皮苷的制备方法，尤其涉及一种利用工程细胞来合成橙皮苷的方法。
技术介绍
橙皮苷是柑橘中一种主要的黄烷酮之一，是甜橙、宽皮柑橘、柠檬等非苦味柑橘果实中含量最丰富的一种黄烷酮糖苷，而在有苦味的柚果实中却检测不到(Rousefetal,1987；Gattusoetal.,2007；Frydmanetal.,2013；Chenetal.,2015)。除了对果实风味的影响外，橙皮苷在抵御病虫侵害方面也具有重要作用(DelRioetal.,2004)。橙皮苷不仅对柑橘风味有重要影响，还具有广泛的药用价值，如在抗氧化、抗癌、抑菌、消炎、预防心脑血管等方面具有显著作用。临床常作为维生素类药(Roohbakhshetal,2014)，橙皮苷经苯丙烷代谢途径合成，是橙皮素两步糖基化后的鼠李糖苷。1,6-鼠李糖基转移酶(1,6-RhaT)是第2步糖基化过程中的关键酶(Frydmanetal,2013)。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术的目的在于：在于提供一种利用工程细胞制备高纯度橙皮苷的方法。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案是：一种橙皮苷的制备方法，包括如下步骤：(1)构建1,6-鼠李糖基转移酶基因的表达载体；(2)将步骤(1)中所构建的表达载体利用农杆菌介导的遗传转化方法转入到愈伤组织中；(3)向步骤(2)所得的愈伤组织中加入橙皮素底物进行悬浮培养；(4)将步骤(3)中所得悬浮细胞进行冷冻干燥后，并将所得干燥物溶于80％甲醇中混匀并进行离心，得到橙皮苷。上述技术方案的有益效果在于：采用上述方法，利用工程细胞利用橙皮素作为底物不断的合成橙皮苷，其效率高，且分离纯化简单，同时能耗低，产物的纯度高。上述技术方案中所述步骤(2)中愈伤组织的为烟草愈伤组织。上述技术方案的有益效果在于：采用烟草愈伤组织作为感染载体，其感染效率高，培养方便。上述技术方案中所述步骤(1)中1,6-鼠李糖基转移酶基因构建方法包括如下步骤：s1:设计并制备1,6-鼠李糖基转移酶基因特异引物:1,6-RhaT-F为SEQIDNO.1,1,6-RhaT-R为SEQIDNO.2；s2:采用PCR方法从甜橙、宽皮柑橘或柠檬果实的cDNA中扩增得到1,6-鼠李糖基转移酶基因的序列全长；s3:回收1,6-鼠李糖基转移酶基因的序列后并与工程菌的质粒DNA连接；s4:将上述工程菌转化到感受态大肠杆菌菌株中；s5:筛选阳性的大肠杆菌菌株进行增殖并提取质粒；s6:将步骤s5中获得的质粒利用GateWay试剂盒构建转化载体，并测序，选择阳性菌液提取质粒，所得质粒即为1,6-鼠李糖基转移酶基因的表达载体。上述技术方案的有益效果在于：其方便简单。上述技术方案中所述转化载体为带有潮霉素抗性标记的PHTWG2D。上述技术方案的有益效果在于：便于检测。上述技术方案中所述大肠杆菌菌株为转入效果好。上述技术方案中所述步骤(4)中冷冻干燥时间为3d；离心时以4000g的离心力离心10min。上述技术方案的有益效果在于：尽量将培养液中的杂质除去，便于获得高浓度的橙皮苷。附图说明图1，农杆菌介导转化后悬浮组织第一天的照片；图2，农杆菌介导转化后悬浮组织第四十天的照片；图3，农杆菌介导转化后悬浮组织第六十天的照片；图4，农杆菌介导转化继代到三角瓶中的转基因愈伤；图5，农杆菌介导转入到愈伤阳性细胞的荧光检测；图6，农杆菌介导转入到愈伤阳性细胞的PCR阳性检测；图7，高效液相色谱检测转基因愈伤和野生型中橙皮苷含量的对比图。具体实施方式以下结合附图对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。<实施例1>1,6-鼠李糖基转移酶基因的表达载体的构建；所述步骤(1)中1,6-鼠李糖基转移酶基因构建方法是：s1:利用PrimerPremier5.0软件设计并制备1,6-鼠李糖基转移酶基因特异引物：1,6-RhaT-F为SEQIDNO.1；1,6-RhaT-R为SEQIDNO.2；s2:采用PCR方法从甜橙的果实的cDNA中扩增得到1,6-鼠李糖基转移酶基因的序列全长；s3:回收1,6-鼠李糖基转移酶基因的序列后并与工程菌的质粒DNA连接；s4:将上述工程菌转化到感受态大肠杆菌Trans5α菌株中；s5:筛选阳性的大肠杆菌菌株进行增殖并提取质粒；s6:将步骤s5中获得的质粒利用GateWay试剂盒构建转化载体，所述转化载体为带有潮霉素抗性标记的PHTWG2D，并测序，选择阳性菌液提取质粒，所得质粒即为1,6-鼠李糖基转移酶基因的表达载体。<实施例2>工程细胞的构建将实施例1中所构建的表达载体通过热激化法转化农杆菌GV3101菌株转入到BY2烟草愈伤组织中。向2g鲜重BY2烟草愈伤中加入40mL液体MS培养基，28℃摇床(130rpm)中黑暗培养。每7d继代1次，继代时静置数分钟，倒掉2/3原培养基，加入新MS培养基，继代1次后悬浮系生长迅速，颜色淡黄，分散性及均一性好且能长期保存。BY2悬浮细胞继代3-4d时处于指数增长期，取4mL此时的悬浮细胞和100μL预培养24h的农杆菌，共培养于小培养皿中暗培养48h，然后用15mL新鲜培养基洗BY2细胞2-3次，将细胞低密度选择MS固体平板上。4周后分离筛选转基因愈伤到新鲜MS固体选择平板上，转基因愈伤筛选过程具体见图1-4。<实施例3>转基因阳性愈伤的鉴定利用体式显微镜检测愈伤荧光，在显微镜下发荧光的即为阳性愈伤其结果如图5所示；提取愈伤的DNA，利用特异引物扩增得到目的条带的为阳性愈伤，如图6所示。鉴定的结果表明阳性愈伤即可用于合成橙皮苷。<实施例4>橙皮苷的合成阳性BY2烟草愈伤悬浮培养1周后，向1g烟草悬浮愈伤中加入20mL液体MS培养基，28℃摇床(130rpm)中黑暗培养4d。4d后向悬浮愈伤中加入50μL橙皮素(底物溶解在DMSO中，浓度为1mg/mL)，重复3次，28℃摇床(130rpm)黑暗悬浮培养48h。收集培养好的悬浮愈伤置于冷冻干燥仪中冻干(约3d)，称取约0.26g干样置于10mL离心管中，加入5mL80voL％％甲醇，混匀，置于超声波清洗仪中，40℃超声1h。4000g离心10min，吸取上清液置于新的10mL离心管中，置于旋转蒸发仪中浓缩至干燥(45℃，4h)，所得干燥物即为橙皮苷。向所得橙皮苷干燥物中加入1mL浓度为80voL％甲醇进行溶解，过0.22μm滤膜，经高效液相色谱分离检测分析其浓度达到95％。<实施例5>分别向野生型(图7C)和转基因愈伤(图7D)中添加底物-橙皮素后，第一步糖基化作用能够利用烟草悬浮细胞自身的7-O-葡萄糖苷转移酶(7-GlcT)和/或7-O-二葡萄糖苷转移酶(7-dGlcT)的作用下进行的；接着第二步糖基化在转基因愈伤中1,6-RhaT的催化下特异地大量产生橙皮苷，而野生型愈伤和添加水的转基因愈伤(图7B)则不能合成橙皮苷。该方法合成的橙皮苷纯度高、快速简单易行，其中图7A为橙皮苷标样。其中：SEQIDNO.1为人工序列：atgcacgccccttcgaacc；SEQIDN本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种橙皮苷的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)构建1,6‑鼠李糖基转移酶基因的表达载体；(2)将步骤(1)中所构建的表达载体利用农杆菌介导的遗传转化方法转入到愈伤组织中；(3)向步骤(2)所得的愈伤组织中加入橙皮素底物进行悬浮培养；(4)收集步骤(3)中所得悬浮细胞进行冷冻干燥后，并将所得干燥物溶于80％甲醇中混匀并进行离心，得到橙皮苷。

【技术特征摘要】
1.一种橙皮苷的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)构建1,6-鼠李糖基转移酶基因的表达载体；(2)将步骤(1)中所构建的表达载体利用农杆菌介导的遗传转化方法转入到愈伤组织中；(3)向步骤(2)所得的愈伤组织中加入橙皮素底物进行悬浮培养；(4)收集步骤(3)中所得悬浮细胞进行冷冻干燥后，并将所得干燥物溶于80％甲醇中混匀并进行离心，得到橙皮苷。2.根据权利要求1所述的橙皮苷的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中愈伤组织的为烟草愈伤组织。3.根据权利要求1所述的橙皮苷的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中1,6-鼠李糖基转移酶基因构建方法包括如下步骤：s1:设计并制备1,6-鼠李糖基转移酶基因特异引物:1,6-RhaT-F为SEQIDNO.1,1,6-RhaT-R为SEQIDNO.2；s2:采用PCR方法从甜橙、宽...

【专利技术属性】
技术研发人员：李文云，徐娟，陈嘉景，袁子彧，彭昭欣，石梅艳，何珍玉，田静，
申请(专利权)人：华中农业大学，贵州省果树科学研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42