一种黄瓜CsWRKY50基因在增强黄瓜霜霉病抗性中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种黄瓜CsWRKY50基因在增强黄瓜霜霉病抗性中的应用，其具体应用是使黄瓜CsWRKY50基因在黄瓜植株中进行过表达，所述黄瓜CsWRKY50基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明专利技术首次发现CsWRKY50在黄瓜中过表达可以显著提高黄瓜对霜霉病的抗性，通过实验证明，将黄瓜CsWRKY50基因作为目的基因导入黄瓜植株中，通过改变黄瓜CsWRKY50基因在黄瓜植株中的表达量，增加了抗性基因的表达，提高了黄瓜霜霉病的抗性，该特性在黄瓜育种中，通过基因检测手段，选择黄瓜CsWRKY50基因过表达的植株，从而对抗霜霉病的黄瓜品种进行选育，其应用方法安全、可靠，在选育黄瓜抗性品种等研究方面具有很好的应用前景。

Application of cucumber CsWRKY50 gene in enhancing cucumber downy mildew resistance

The invention discloses the application of cucumber CsWRKY50 gene in enhancing cucumber downy mildew resistance. The specific application is to make cucumber CsWRKY50 gene overexpress in Cucumber plants. The nucleotide sequence of cucumber CsWRKY50 gene is shown as SEQ ID NO:1. It was found for the first time that the overexpression of CsWRKY50 in Cucumber could significantly improve the resistance of cucumber to downy mildew. It was proved by experiments that the cucumber CsWRKY50 gene was introduced into cucumber plants as the target gene, and the expression of resistance gene was increased by changing the expression level of cucumber CsWRKY50 gene in Cucumber plants. Resistance to downy mildew, this characteristic in Cucumber breeding, through gene detection means, select cucumber CsWRKY50 gene overexpression plants, thus resistant to downy mildew cucumber varieties for breeding, its application method is safe and reliable, in the breeding of cucumber resistant varieties and other research has a good prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种黄瓜CsWRKY50基因在增强黄瓜霜霉病抗性中的应用
本专利技术涉及农作物基因工程
，具体地说是一种黄瓜CsWRKY50基因在增强黄瓜霜霉病抗性中的应用。
技术介绍
黄瓜(CucumissativusL.)葫芦科草本植物，是国际上普遍栽培的蔬菜作物，黄瓜具有多种保健作用，深受人们的喜爱。目前我国主要以温室和大棚栽培为主，由于温室、大棚内特殊的气候条件和连作种植，黄瓜易受到各种病害的侵袭，其中最为严重的有霜霉病、白粉病、灰霉病等。这些病害发病及蔓延速度快，造成产量大幅度的下降，品质变劣，植株早衰等一系列问题。为了解决这一问题，人们通常依靠喷洒大量化学农药来防治黄瓜作物的病害侵袭，但是众所周知，喷洒农药不仅会使病菌产生抗药性，而且会导致黄瓜果实残留大量农药，进而严重威胁食用人群的健康。因此，抗病的优质品种是黄瓜高效生产更经济、环保的途径。黄瓜霜霉病主要发生在叶片上。苗期发病，子叶上起初出现褪绿斑，逐渐呈黄色不规则形斑，潮湿时子叶背面产生灰黑色霉层，随着病情发展，子叶很快变黄，枯干。成株期发病，叶片上初现浅绿色水浸斑，扩大后受叶脉限制，呈多角形，黄绿色转淡褐色，后期病斑汇合成片，全叶干枯，由叶缘向上卷缩，潮湿时叶背面病斑上生出灰黑色霉层，严重时全株叶片枯死。黄瓜霜霉病是黄瓜栽培中发生最普遍、为害最严重的病害之一。病情来势猛，发病重，传播快，如不及时防治，将给黄瓜造成毁灭性的损失。目前，挖掘重要的抗逆基因，并应用现代分子生物学技术将抗逆基因与其它优良性状聚合，是获得耐逆性强、抗病性强以及高产、优质黄瓜品种的有效方法之一。对这些胁迫相关基因进行功能研究是开发利用这些基因的前提。而WRKY转录因子在植物的生物胁迫、非生物胁迫应答以及生长发育过程中起着至关重要的调控作用。这类转录因子通过与靶基因启动子中特定的DNA序列结合，调控位于下游的靶基因转录表达，有的参与信号通路转导。因此，WRKY基因及其调控的靶基因都是潜在的重要的抗逆基因，开发其在黄瓜中新的功能并将其应用，是行业内研发人员积极探索的课题之一。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种黄瓜CsWRKY50基因在增强黄瓜霜霉病抗性中的应用，以解决目前黄瓜作物在栽种中容易受到霜霉病侵袭从而造成产量下降、施用农药污染严重的问题。本专利技术是采用以下技术方案实现的：一种黄瓜CsWRKY50基因在增强黄瓜霜霉病抗性中的应用，利用转基因技术，将所述黄瓜CsWRKY50基因在黄瓜植株中进行过表达，所述黄瓜CsWRKY50基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。所述黄瓜CsWRKY50基因在增强黄瓜霜霉病抗性中的应用，其具体应用方法为：(a)利用35S强启动子构建黄瓜CsWRKY50基因过表达载体；(b)将含黄瓜CsWRKY50基因的过表达载体转入农杆菌感受态细胞中，获得含黄瓜CsWRKY50基因过表达载体的农杆菌工程菌；(c)将所述农杆菌工程菌转入到黄瓜植物体内，得到含有过表达黄瓜CsWRKY50基因的、抗霜霉病的黄瓜植株。步骤(a)所述黄瓜CsWRKY50基因过表达载体为pBI121-35S::CsWRKY50。一种黄瓜CsWRKY50基因在增强黄瓜霜霉病抗性中的应用，在选育抗霜霉病黄瓜品种或品系时，利用基因技术手段检测其植株中黄瓜CsWRKY50基因的过表达情况，选择黄瓜CsWRKY50基因过表达量高的植株作为育种的亲本植株。本专利技术通过构建黄瓜CsWRKY50过表达载体在黄瓜植株中过表达，增强了黄瓜对霜霉病的抗性，通过霜霉菌接种实验数据统计分析证明，野生型接种霜霉病后2天，其发病部位背面有水泽状，8天后叶片正面有病斑，严重的部位枯死。而本专利技术通过过表达黄瓜CsWRKY50基因后的叶片2天没有任何症状，8天后只有一小块病斑，其大部分仍然是正常的，由此证实了过表达黄瓜CsWRKY50基因可明显增强黄瓜霜霉病的抗性。本专利技术的创造性贡献在于首次发现CsWRKY50基因在黄瓜中过表达可以显著提高黄瓜对霜霉病的抗性，这对黄瓜安全生产具有重要意义。因此，本专利技术提供的黄瓜CsWRKY50基因可作为目的基因导入黄瓜植株中，通过改变黄瓜CsWRKY50基因在黄瓜植株中的表达量、增加了抗性基因的表达，提高了黄瓜霜霉病的抗性，还可在黄瓜育种中，通过基因检测手段，选择过表达黄瓜CsWRKY50基因的黄瓜植株，从而对抗霜霉病的黄瓜品种进行选育，其应用方法安全、可靠，利用转基因技术，将所述黄瓜CsWRKY50基因在黄瓜植株中进行过表达。附图说明图1为本专利技术黄瓜CsWRKY50基因的扩增目的片段图。图2为本专利技术的遗传转化过程状态图。图3为本专利技术筛选的株系与非转基因对照植株表达量的差异图。图4为本专利技术与非转基因对照植株的叶片感霜霉病后不同时间下的表型对比图。图5为本专利技术与非转基因对照植株的叶片感霜霉病后不同时间下的表型量化图。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，若未特别指明，实施例中的培养基及实验条件均为常规培养基和实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,Molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件进行。实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1黄瓜CsWRKY50基因的克隆和过表达载体的构建(1)黄光品种选新泰密刺为试材。该品种为生长势强，第4～5节着生根瓜，瓜形棒状，匀称，青绿色，刺瘤密，有纵棱，但不明显。将黄瓜种子播于日光温室中，进行普通的栽培管理，待植株开始结瓜时，取嫩叶液氮速冻，采用Trizol(购自LifeTechnologies公司)提取液的方法提取黄瓜幼嫩叶片的RNA，用ThermoFisher公司的反转录试剂盒进行反转录得到cDNA，存于-20℃保存备用。(2)设计黄瓜CsWRKY50基因带酶切位点的扩增引物，引物序列及所携带的酶切位点如下(带有下划线的为酶切位点序列)：(3)以黄瓜叶片的cDNA为模板，PCR扩增带酶切位点的CsWRKY50基因的编码区序列。反应体系如下：PCR扩增条件如下：得到了CsWRKY50基因462bp的片段，如图1所示，进行回收。(4)回收目的片段：取25μL的PCR扩增产物在质量体积比浓度为1.2％的琼脂糖凝胶中电泳检测，切割目的片段，参照凝胶回收试剂盒(康为世纪)附带的说明书进行操作，得目的基因片段，连接克隆载体pEASY上，体系如下：加入反应液，混匀，于PCR仪中25℃连接30min，得连接产物。(5)转化及筛选：从-80℃冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞，放置冰上解冻，无菌操作台中将25μL大肠杆菌感受态细胞和5μL的所述连接产物移入1.5mL离心管中，轻轻混匀，冰浴30min；打开水浴锅在42℃水浴中热激90s后立即冰浴2-5min，该操作过程中保持离心管绝对静止；在无菌操作台中加入800μL液体LB，放置于37℃，200rpm摇床上培养45min；12000rpm离心1min，弃上清，用80μL的液体LB悬浮沉淀，将菌液均匀的涂布于含Kan(50mg·L-1)的LB平板培养基上，37℃倒置过夜培养至长出单克隆菌落；挑取阳性单克隆送至本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种黄瓜CsWRKY50基因在增强黄瓜霜霉病抗性中的应用，其特征在于，利用转基因技术，将所述黄瓜CsWRKY50基因在黄瓜植株中进行过表达，所述黄瓜CsWRKY50基因的核苷酸序列如SEQ ID NO : 1所示。

【技术特征摘要】
1.一种黄瓜CsWRKY50基因在增强黄瓜霜霉病抗性中的应用，其特征在于，利用转基因技术，将所述黄瓜CsWRKY50基因在黄瓜植株中进行过表达，所述黄瓜CsWRKY50基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。2.根据权利要求1所述的黄瓜CsWRKY50基因在增强黄瓜霜霉病抗性中的应用，其特征在于，方法为：（a）构建含黄瓜CsWRKY50基因过表达载体；（b）将含黄瓜CsWRKY50基因过表达载体转入农杆菌感受态细胞中，获得含黄瓜CsWRKY50基因过表达载体的农杆菌工程菌；（c）将所述农杆...

【专利技术属性】
技术研发人员：任仲海，栾倩倩，刘梦雨，刘盼静，张振，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37