同时表达两个外源蛋白载体TRVe制造技术

本发明专利技术公开了一种同时表达两个外源蛋白载体TRVe2的构建方法，以TRV的基因组RNA2的农杆菌侵染性克隆pYL156为材料，构建含有TRV的2b基因启动子和豌豆早枯病毒外壳蛋白基因启动子序列的载体，通过这2个植物病毒的基因组启动子驱动外源基因在本氏烟中表达。本发明专利技术的同时表达2个非融合蛋白的植物病毒TRV2e2在国际上首次报道；该病毒在本氏烟不引起明显的症状，携带2个外源基因后能系统性扩展至整个植株，并在同一个细胞中表达2个外源蛋白。

Simultaneous expression of two foreign protein vectors TRVe

The invention discloses a construction method for simultaneously expressing two exogenous protein vectors TRVe2. Using the Agrobacterium tumefaciens infectious clone pYL156 of TRV genomic RNA 2 as the material, the vector containing the promoter sequence of 2b gene and the promoter sequence of the coat protein gene of pea premature blight virus is constructed, through which the genomic promoters of the two plant viruses are passed. Foreign genes were driven to express in Benedict tobacco. The plant virus TRV2e2, which simultaneously expresses two non-fusion proteins, has been reported for the first time in the world; the virus does not cause obvious symptoms in Ben's cigarette smoke; it can systematically extend to the whole plant after carrying two exogenous genes and express two exogenous proteins in the same cell.

【技术实现步骤摘要】
同时表达两个外源蛋白载体TRVe2的构建方法与应用
本专利技术涉及分子生物学领域，具体包括在整个植物中同时表达2种非融合外源蛋白的植物病毒表达载体构建方法与应用。
技术介绍
植物病毒基因组一般较小，易于进行分子生物学操作,且病毒侵染寄主的过程简单，因此利用植物病毒载体表达外源基因在生物
具有潜在的应用优势。植物病毒正日益成为重组蛋白表达系统的备选方案，而未来植物病毒表达载体的发展方向将会是利用谷类、豆类等粮油经济农作物来作为生物反应器生产可食用疫苗。与植物转基因生产外源蛋白相比，植物病毒表达系统具有以下优势：第一、病毒增殖水平较高，可使伴随的外源基因高水平表达；其次、病毒增殖速度快，外源基因在很短时间可达最大量的积累；第三、病毒基因组小，易于进行遗传操作，适于大规模商业操作；第四、宿主范围广，扩大基因工程的宿主范围；第五、病毒颗粒易于纯化，可显著降低下游生产成本。植物作为生物反应器生产“分子医药”技术具有高效、可量化和成本低的特点，以植物产生的重组药用蛋白也不受细菌毒素和动物病原体的干扰；并且作为真核生物，植物表达系统能够通过翻译后修饰如糖基化、剪切信号肽等方式来产生人类和医药相关的蛋白。植物病毒表达系统非常适合用来生产药用蛋白，已有大量的植物病毒用于表达病毒粒子表面展示短多肽。目前已有大量植物病毒成功地应用疫苗的生产，如烟草花叶病毒(Tobaccomosaicvirus,TMV)、豇豆花叶病毒(Cowpeamosaicvirus,CPMV)，苜蓿花叶病毒(Alfalfamosaicvirus,AMV)，马铃薯病毒X(PotatovirusX,PVX)、马铃薯Y病毒(PotatovirusY,PVY)和番茄丛矮病毒(Tomatobushystuntvirus,TBSV)等众多的植物病毒。TMV和PVX表达载体是目前最常用的植物病毒表达载体，广泛地应用于表达药用蛋白以及蛋白的生物学功能研究。构建一个理想的植物病毒载体所选择的病毒应具有如下特点：(1)病毒基因组小，易于遗传操作并已构建成侵染性克隆；(2)病毒基因组的结构和功能清楚且能高水平复制和翻译，具有外源基因表达的有效启动子，改造过的病毒能局部和系统运动；(3)弱毒株系，在寄主植物中不引起症状反应或轻微的症状反应；(4)病毒携带外源基因后在寄主中能遗传稳定存活；(5)寄主范围广。不同的病毒其基因组结构和功能不同，构建病毒外源蛋白表达载体的策略也不同。基于植物病毒构建表达外源蛋白的载体可通过缺失替换、基因插入、亚基因组翻译和表位表达等方式获得。外源基因替换病毒复制的非必需基因是目前构建植物病毒瞬时表达载体的最常用的手段；直接将外源基因插入到病毒基因组而不需要缺失病毒基因，但这种方法对外源基因的大小有限制，并且在寄主植物中病毒很容易发生重组造成外源蛋白的基因丢失；在病毒整个基因组中合适区域例外插入一个同属病毒的亚基因启动子序列获得植物病毒表达载体能系统性的侵染整个植物，但是该载体在多次病毒转接后容易发生目的蛋白基因丢失现象。表位表达载体是用来生产免疫原性肽和蛋白，将外源基因的开放阅读框与病毒的开放阅读框融合，由于外源蛋白和病毒蛋白共同表达而避免在寄主中外源插入的基因序列缺失；在植物病毒表位表达载体系统中，外源蛋白一般设计成与病毒的外壳蛋白相融合，从而使得外源蛋白裸露在病毒粒子表面。改造过病毒粒子对生产新型疫苗有着潜在的吸引力，由于改造过的病毒粒子易于纯化，并且抗原肽显露在表面能极大的提高它的免疫原性。多肽表达系统包括将完整的外源基因引入病毒基因组并在侵染的植物中快速高效地表达，抗原表位展示技术是通过植物病毒来大规模生产医用疫苗最有效的方法之一。植物病毒表达载体多为表达单个外源蛋白，目前越来越多的植物病毒用于构建表达多个外源蛋白的载体。利用病毒自身蛋白水解酶的特性将外源基因插入P1/HC-Pro及NIb/CP的马铃薯病毒A(PotatovirusA,PVA)三基因表达载体，基于大豆花叶病毒(Soybeanmosaicvirus,SMV)双基因表达载体。PVA和SMV均属于马铃薯Y病毒属(PotatovirusY,PVY)成员，PVY属病毒的整个基因组分布在1条RNA分子上，编码一个大的多功能多聚蛋白，并通过自身编码的蛋白酶将多聚蛋白水解加工成有功能的单个蛋白，如P1、Hc-Pro、P3、6K1、CI、6K2、VPg、NIaPro、NIb和CP等蛋白。通过将绿色荧光蛋白(Greenfluorescentprotein,GFP)基因插入到PVA的5'端非编码区和P1基因间区域、海肾荧光素酶(Ranillaluciferase,Rluc)基因克隆P1和Hc-Pro基因间区域和在以及葡糖醛酸酶(Glucuronide,GUS)基因插入到NIb和CP间区域获得在寄主植物中同时表达GFP、Rluc和GUS载体pGLU。改造后的PVA载体pGLU侵染寄主植物后先翻译出多聚体大蛋白，再由P1蛋白和辅助蛋白HC-Pro等水解酶将该大蛋白切割成众多小蛋白，最终获得目的蛋白GFP、Rluc和GUS。在P1/HC-Pro和NIb/CP间插入外源蛋白序列是PVY属病毒构建表达多个外源蛋白的最常用的策略，目前成功地应用于构建基于菁花叶病毒(Turnipmosaicvirus,TuMV)、小西葫芦黄花叶病毒(Zucchiniyellowmosaicvirus,ZYMV)、烟草脉斑驳病毒(Tobaccoveinmottlingvirus,TEMV)等植物病毒的外源蛋白表达载体。基于PVY属病毒成员的基因组反应策略而构建的的多基因表达载体是等量表达多个外源目的蛋白，并且所表达的目的蛋白的两端均含有来源于病毒蛋白的氨基酸残基，而目的蛋白携带其它蛋白的氨基酸残基可能影响其生物学功能。植物病毒表达载体中，利用手足口病病毒(Footandmouthdiseasevirus，FMDV)肽酶2A自我切割活性从病毒的一个开放阅读框(OpenReadingFrame,ORF)中表达外源蛋白的技术成功地应用于构建CPMV、扁豆花叶病毒(Beanpodmottlevirus，BPMV)以及烟草环斑病毒(Tobaccoringspotvirus，TRSV)外源蛋白表达载体。通过肽酶2A的核苷酸序列将病毒蛋白ORF的3'端与外源蛋白ORF的5'端相连接，经改造后的病毒接种寄主植物后将融合外源蛋白的病毒蛋白翻译出来，并在肽酶2A的作用下，水解成病毒蛋白和外源蛋白；如利用TRSV载体pT2C2AGFP表达GFP，在本氏烟中能有效地表达5种含有GFP的蛋白(MP-GFP-2A-CP、MP-GFP-2A、GFP-2A-CP、GFP-2A和GFP)，但4种融合蛋白(MP-GFP-2A-CP、MP-GFP-2A、GFP-2A-CP和GFP-2A)为主要成分，而游离的GFP含量极少。在BPMV的MP/L-CP之间插入肽酶2A的碱基序列而构建的表达2个外源基因的载体pBPMV-IV-5V能有效地同时表达GFP和除草剂抗性蛋白BAX，但是大部分的目的蛋白以MP-GFP、GFP-2A、BAX-L-CP和BAX-2A等融合蛋白的形式存在植物中。烟草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus,TRV))是烟草脆裂本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.同时表达两个外源蛋白载体TRVe2的构建方法，其特征是：以TRV的基因组RNA2的农杆菌侵染性克隆pYL156为材料，构建含有TRV的2b基因启动子和豌豆早枯病毒外壳蛋白基因启动子序列的载体，通过这2个植物病毒的基因组启动子驱动外源基因在本氏烟中表达。

【技术特征摘要】
1.同时表达两个外源蛋白载体TRVe2的构建方法，其特征是：以TRV的基因组RNA2的农杆菌侵染性克隆pYL156为材料，构建含有TRV的2b基因启动子和豌豆早枯病毒外壳蛋白基因启动子序列的载体，通过这2个植物病毒的基因组启动子驱动外源基因在本氏烟中表达。2.根据权利要求1所述的同时表达两个外源蛋白载体pTRV2e2的构建方法，其特征是依次包括以下步骤：1)、以TRV基因组RNA2的T-DNA侵染性克隆pYL156为载体，构建缺失TRV的2b基因并含有多克隆位点的重组质粒pTRV2e1；2)、在pTRV2e1插入PEBV的CP基因亚基因组启动子序列和多克隆位点MCS2获得载体pTRV2e2；3)、PCR扩增gfp基因序列并通过双酶切连接至质粒pTRV2e1，获得载体pTRV2e1-gfp；4)、以质粒pTRV2e1-gfp为模板，PCR扩增、双酶切克隆至质粒pTRV2e2中，获得载体pTRV2e2-MCS1-gfp；5)、PCR扩增rfp基因序列并通过双酶切克隆至pTRV2e2-MCS1-gfp，获得到载体pTRV2e2-rfp-gfp；所述载体pTRVe2-rfp-gfp农杆菌转化后，并与农杆菌pTRV1混和接种于本氏烟中，病毒TRVe2-rfp-gf...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖乾生，常发光，杜志游，刘小红，林福呈，
申请(专利权)人：浙江理工大学，浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33