含烟草PDS基因片段的黄瓜花叶病毒RNA2弱毒突变型质粒载体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了含烟草PDS基因片段的黄瓜花叶病毒RNA2弱毒突变型质粒载体及其应用。所述质粒载体含有CMVFny株系RNA2全序列，并在2a蛋白终止密码子后插入有烟草PDS基因199bp的片段。该质粒载体与含野生型CMVFny RNA1和野生型CMVFnyRNA3的质粒通过农杆菌浸润方法接种本氏烟，可显示弱致病症状以及不依赖仪器可裸眼判断其诱导基因沉默的能力；为弱毒疫苗的深入研究提供极大便利。

Cucumber mosaic virus RNA2 attenuated mutant plasmid vector containing tobacco PDS gene fragment and its application

The present invention discloses attenuated mutant plasmid vector of cucumber mosaic virus RNA 2 containing tobacco PDS gene fragment and its application. The plasmid vector contains the complete RNA 2 sequence of CMVFny strain and inserts a 199bp fragment of tobacco PDS gene after the codon termination of 2A protein. The plasmid vector and the plasmid containing wild type CMVFny RNA 1 and wild type CMVFny RNA 3 were inoculated with Agrobacterium tumefaciens, which showed the weakly pathogenic symptoms and the ability of inducing gene silencing without the aid of instruments.

【技术实现步骤摘要】
含烟草PDS基因片段的黄瓜花叶病毒RNA2弱毒突变型质粒载体及其应用
本专利技术涉及植物病毒学和分子生物学
，具体涉及一种含烟草PDS基因片段的黄瓜花叶病毒RNA2弱毒突变型质粒载体及其应用。
技术介绍
黄瓜花叶病毒(Cucumermosaicvirus，CMV)是目前已知的寄主范围最广的植物病毒之一，可侵染100多科2000多种植物。造成多种具有重要经济价值的植物(农作物、园艺作物等)出现黄化、矮化、畸形等症状，严重影响其产量和品质。对于植物病毒病的防治，最有效的方法是抗病品种的筛选与培育，但其存在育种周期长、抗病品种抗性易丧失等不足。另一种方法是弱毒交叉保护，是利用弱毒刺激植物自身的免疫系统而防治后期侵染的强毒株系；是一种行之有效的病毒防治策略。弱毒突变体可以是天然存在的，也可以通过分子生物学手段进行人工制备。CMV基因组由三条RNA(RNA1、RNA2和RNA3)组成，共编码5个蛋白。RNA1编码的1a蛋白是病毒复制酶重要组分。RNA2编码2a与2b蛋白，其中，2a蛋白具有RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)活性，与1a蛋白共同参与病毒的体内复制(Hampton，1992)；与2a蛋白存在编码序列部分重叠的2b蛋白由亚基因组RNA4A产生，是一种基因沉默抑制因子，能够最大限度地保护病毒基因组不被寄主植物降解(Csorba，2015)。RNA3编码3a蛋白(运动蛋白MP)和外壳蛋白CP；MP与病毒在寄主细胞间移动和长距离移动有关(Palukaitis，2003)，CP由亚基因组RNA4产生，与病毒粒体组装、蚜虫传播、病毒血清型及寄主症状表现有关(Palukaitis，1992；Edwardson，1991；Roossinck，2001；Chen，1990；Ding，1994)。由于CMV的2b蛋白是病毒编码的基因沉默抑制因子，对寄主植物对病毒基因组的基因沉默作用有很强的抑制作用，因此，在保持2a蛋白完整性的前提下，对2b蛋白的编码基因进行突变改造是构建CMV弱毒突变体的研究热点。
技术实现思路
针对上述研究背景，本专利技术的目的是提供一种含烟草PDS基因片段的黄瓜花叶病毒RNA2弱毒突变型质粒载体及其应用。本专利技术针对2b蛋白编码序列进行改造获得弱毒突变体，同时在弱毒突变体改造过程中插入烟草PDS基因片段，可形成裸眼可视型诱导基因沉默症状，为基于CMV的弱毒疫苗的深入研究提供了极大便利。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一方面，提供一种含烟草PDS基因片段的黄瓜花叶病毒RNA2弱毒突变型质粒载体pCB301-CMVFny2-PDS199-Q，所述质粒载体含有CMVFny株系RNA2全序列，并在2a蛋白终止密码子后插入有烟草PDS基因片段；造成2b蛋白提前终止的同时尽可能保持了其他病毒核苷酸的潜在的顺式调控作用。优选的，所述烟草PDS基因片段的长度199bp，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。优选的，所述质粒载体pCB301-CMVFny2-PDS199-Q的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术的第二方面，提供上述质粒载体pCB301-CMVFny2-PDS199-Q的制备方法，包括以下步骤：(1)以CMVFnyRNA2侵染性克隆质粒pCB301-CMVFny2为模板，利用反向PCR扩增方法获得中间载体；(2)利用RT-PCR从烟草中扩增得到烟草PDS基因片段；(3)利用酶切和连接方法将PDS基因片段插入到中间载体中，即构建得到含烟草PDS基因片段的黄瓜花叶病毒RNA2弱毒突变型质粒载体。优选的，步骤(1)中，用于反向PCR扩增的引物序列分别如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。优选的，步骤(1)中，所述中间载体是在紧邻2a蛋白终止密码子后的2661位与2662位间引入BamHI，SpeI，SmaI酶切位点，并在酶切位点后添加TAATA与2662位的G构成双终止密码子。优选的，步骤(2)中，用于扩增烟草PDS基因片段的引物序列分别如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示。本专利技术的第三方面，提供上述质粒载体pCB301-CMVFny2-PDS199-Q在植物病毒病防治中的应用；具体的，所述植物病毒病是由黄瓜花叶病毒引起的植物病毒病。进一步的，本专利技术还保护上述质粒载体pCB301-CMVFny2-PDS199-Q在弱毒疫苗制备和/或研究中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术通过对2b蛋白编码序列进行改造获得弱毒突变体，同时在弱毒突变体改造过程中插入烟草PDS基因片段，从而制备得到含烟草PDS基因片段的黄瓜花叶病毒RNA2弱毒突变型质粒载体pCB301-CMVFny2-PDS199-Q。利用本专利技术制备的质粒载体pCB301-CMVFny2-PDS199-Q，与含野生型CMVFnyRNA1和野生型CMVFnyRNA3的质粒通过农杆菌浸润方法共同接种本氏烟，接种12d后，与野生型CMVFnyRNA1+RNA2+RNA3混合接种症状相比显示弱侵染性，表现为株高基本正常且单个叶片较平展；同时系统叶片表现肉眼可见的白化症状，表明该CMV弱毒突变体具备诱导基因沉默的能力，满足弱毒疫苗的基本要求(弱侵染和诱导内源免疫系统)。在此基础上，可以进行外源插入片段长度范围、疫苗提前接种时间等疫苗应用性细节的研究，此肉眼可视性白化症状为基于CMVFny的弱毒疫苗的深入研究提供便利；而且此199bp序列是在已报道的茄科植物PDS基因中较保守的序列，因此本专利技术的弱毒突变体表现出的可视化优势，不仅适用于烟草，还可以潜在应用到其他茄科植物。附图说明图1为中间载体pCB301-CMVFny2-del2b中含有的CMVRNA2及多克隆位点的示意图。图2为中间载体pCB301-CMVFny2-del2b的酶切鉴定结果电泳示意图；其中M为Tiangen公司的D15000+2000分子量标准，酶切后片段约为7.6kb；质粒为pCB301-CMVFny2-del2b。图3为烟草PDS保守片段的PCR产物电泳结果示意图；其中M为Novoprotein公司的DNALadder2000，PCR产物应为200bp。图4为质粒载体pCB301-CMVFny2-PDS-Q的酶切鉴定结果电泳示意图；其中M为Tiangen公司的D15000+2000，酶切后得到中间载体和200bp插入的PDS片段。图5为质粒载体pCB301-CMVFny2-PDS-Q的生物学效应；其中mock为空农杆菌侵染，CMVFnyR1+R2+R3表示CMVFny野生型RNA1+RNA2+RNA3混合侵染；CMVFnyR1+R2-PDS-Q+R3表示CMVFnyRNA2的PDS-Q插入突变体与野生型RNA1+RNA3混合侵染。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。正如
技术介绍
所介绍的，对2b蛋白的编码基因进行改造是目前研究的热点，例如，有研究采用外源片段替换2b蛋白编码基因的策略。而本专利技术对于2b蛋白编码基因的改造策略为：以CMVFnyRNA2侵染性克隆质粒pCB301-CMVFny2(姚敏，2011)为模板，利用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种含烟草PDS基因片段的黄瓜花叶病毒RNA2弱毒突变型质粒载体pCB301‑CMVFny2‑PDS199‑Q，其特征在于，所述质粒载体含有CMVFny株系RNA2全序列，并在2a蛋白终止密码子后插入有烟草PDS基因199bp的片段。

【技术特征摘要】
1.一种含烟草PDS基因片段的黄瓜花叶病毒RNA2弱毒突变型质粒载体pCB301-CMVFny2-PDS199-Q，其特征在于，所述质粒载体含有CMVFny株系RNA2全序列，并在2a蛋白终止密码子后插入有烟草PDS基因199bp的片段。2.根据权利要求1所述的质粒载体，其特征在于，所述烟草PDS基因199bp的片段，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。3.根据权利要求1所述的质粒载体，其特征在于，所述质粒载体的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。4.权利要求1-3任一项所述的质粒载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以CMVFnyRNA2侵染性克隆质粒pCB301-CMVFny2为模板，利用反向PCR扩增方法获得中间载体；(2)利用RT-PCR从烟草中扩增得到烟草PDS基因片段；(3)利用酶切和连接方法将PD...

【专利技术属性】
技术研发人员：原雪峰，刘珊珊，曹欣然，于成明，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37