一种干细胞定向培养的方法技术

一种干细胞定向培养的方法，包括以下步骤：S1、用培养液对角膜环组织细胞进行定向分化培养得到原代培养物；S2、对步骤S1得到的原代培养物进行冲洗消毒，去除角膜内皮及后弹力层；S3、将步骤S2中剩余的角膜组织置于2.4U/ml Dispase II内，于37℃5％CO2孵箱内孵育；S4、用显微镊子分离角膜上皮组织，并收集分离获得的角膜上皮组织，于0.25％胰酶37℃消化10分钟，得到角膜缘干细胞的单细胞悬液；S5、将步骤S4中得到的单细胞悬液进行传代培养4‑6代得到角膜缘干细胞。

A method of stem cell oriented culture

A method of directional culture of stem cells includes the following steps: S1, directional differentiation of corneal ring cells with culture medium to obtain primary culture; S2, washing and disinfecting the primary culture obtained by S, removing corneal endothelium and the posterior elastic layer; S3, placing the remaining corneal tissue in S 2 at 2.4 U/ml. Dispase II was incubated in the incubator of 5% CO2 at 37 C; S4, corneal epithelial tissue was isolated by microforceps, and the isolated corneal epithelial tissue was collected and digested at 0.25% trypsin 37 C for 10 minutes to obtain the single cell suspension of limbal stem cells; S5, the single cell suspension obtained from S4 was subcultured for 4_ 6 generations. To corneal limbal stem cells.

【技术实现步骤摘要】
一种干细胞定向培养的方法
本专利技术涉及生物领域，尤其涉及一种干细胞定向培养的方法。
技术介绍
干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。干细胞有两种分类方法，一是根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞。第二种分类方法是根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞胚胎干细胞主要来自囊胚内细胞团及受精卵发育至桑椹胚之前的早期胚胎细胞。人ES细胞具有2个显著特征:一是它具有体外高度自我更新的能力,二是它可被定向诱导分化为体内各种细胞类型。干细胞有着巨大的医学应用前景，但要将其成功地用于临床实践,必须解决的首要课题是如何保持干细胞在体外不断增殖的同时又维持着不分化状态,即自我更新。干细胞体外培养必须满足2个基本条件，即促进细胞的分裂增殖的同时抑制细胞的分化。现有的干细胞培养技术中常采用饲养层细胞和/或细胞因子来满足上述条件。如ES细胞，常用的饲养层细胞有小鼠胚胎成纤维细胞和STO细胞等，经丧失分裂能力处理，如γ射线照射或丝裂霉素C等处理,这些细胞虽失去分裂能力，但仍可生存并有同化培养液的能力。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种干细胞定向培养的方法。为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：一种干细胞定向培养的方法，包括以下步骤：S1、用培养液对角膜环组织细胞进行定向分化培养得到原代培养物；S2、对原代培养物进行冲洗消毒，去除角膜内皮及后弹力层；S3、将步骤S2中剩余的角膜组织置于2.4U/mlDispaseII内，于37℃5％CO2孵箱内孵育；S4、用显微镊子分离角膜上皮组织，并收集分离获得的角膜上皮组织，于0.25％胰酶37℃消化10分钟，得到角膜缘干细胞的单细胞悬液；S5、将步骤S4中得到的单细胞悬液进行传代培养4-6代得到角膜缘干细胞。优选地，所述步骤S1中的培养液为N2添加剂、B27添加剂、胎牛血清、非必需氨基酸和DMEM/F12的混合液。优选地，所述步骤S2中使用含青霉素-链霉素的PBS平衡盐溶液对原代培养物冲洗消毒。优选地，所述步骤S3中将角膜组织放在孵箱中孵育的时间为80min。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术所述干细胞的培养方法不需对滋养层细胞进行丧失分裂能力处理，步骤简捷、安全，有效地解决了目前人干细胞培养中动物源性污染的问题，并极大地降低了干细胞的培养成本，为今后干细胞的产业化提供了一种安全的有效的廉价的干细胞培养方法。具体实施方式下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。一种干细胞定向培养的方法，包括以下步骤：S1、用培养液对角膜环组织细胞进行定向分化培养得到原代培养物；S2、对原代培养物进行冲洗消毒，去除角膜内皮及后弹力层；S3、将步骤S2中剩余的角膜组织置于2.4U/mlDispaseII内，于37℃5％CO2孵箱内孵育；S4、用显微镊子分离角膜上皮组织，并收集分离获得的角膜上皮组织，于0.25％胰酶37℃消化10分钟，得到角膜缘干细胞的单细胞悬液；S5、将步骤S4中得到的单细胞悬液进行传代培养4-6代得到角膜缘干细胞。优选地，所述步骤S1中的培养液为N2添加剂、B27添加剂、胎牛血清、非必需氨基酸和DMEM/F12的混合液。优选地，所述步骤S2中使用含青霉素-链霉素的PBS平衡盐溶液对原代培养物冲洗消毒。优选地，所述步骤S3中将角膜组织放在孵箱中孵育的时间为80min。本专利技术所述干细胞的培养方法不需对滋养层细胞进行丧失分裂能力处理，步骤简捷、安全，有效地解决了目前人干细胞培养中动物源性污染的问题，并极大地降低了干细胞的培养成本，为今后干细胞的产业化提供了一种安全的有效的廉价的干细胞培养方法。本专利技术建立了一套高效可行的人胚胎干细胞定向分化为角膜缘干细胞的诱导方案，为组织工程角膜上皮构建提供种子细胞；建立了一种采用诱导细胞联合脱细胞羊膜支架构建组织工程眼表的方法，为组织工程化眼表的构建奠定了坚实的基础。以上所述，仅为本专利技术较佳的具体实施方式，但本专利技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
的技术人员在本专利技术揭露的技术范围内，根据本专利技术的技术方案及其专利技术构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本专利技术的保护范围之内。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种干细胞定向培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、用培养液对角膜环组织细胞进行定向分化培养得到原代培养物；S2、对步骤S1得到的原代培养物进行冲洗消毒，去除角膜内皮及后弹力层；S3、将步骤S2中剩余的角膜组织置于2.4U/ml Dispase II内，于37℃5％CO2孵箱内孵育；S4、用显微镊子分离角膜上皮组织，并收集分离获得的角膜上皮组织，于0.25％胰酶37℃消化10分钟，得到角膜缘干细胞的单细胞悬液；S5、将步骤S4中得到的单细胞悬液进行传代培养4‑6代得到角膜缘干细胞。

【技术特征摘要】
1.一种干细胞定向培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、用培养液对角膜环组织细胞进行定向分化培养得到原代培养物；S2、对步骤S1得到的原代培养物进行冲洗消毒，去除角膜内皮及后弹力层；S3、将步骤S2中剩余的角膜组织置于2.4U/mlDispaseII内，于37℃5％CO2孵箱内孵育；S4、用显微镊子分离角膜上皮组织，并收集分离获得的角膜上皮组织，于0.25％胰酶37℃消化10分钟，得到角膜缘干细胞的单细胞悬液；S5、将步骤S4中得到的单细胞悬液...

【专利技术属性】
技术研发人员：佟艳辉，李鹏，
申请(专利权)人：中科政兴上海医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31