一种生物工程培育眼全层角膜的方法技术

本发明专利技术涉及细胞培养领域，特别涉及一种生物工程培育眼全层角膜的方法，角膜各层分别培养，优点在于当病人不需要全角膜移植时，只需要培养患者需要的角膜层即可。本发明专利技术中提供的全角膜的制备方法，角膜表皮层和间质层的种子细胞是自体细胞，并且角膜内皮细胞来自捐赠者，可通过培养得到大量的内皮细胞，避免了捐赠者来源的有限性。本发明专利技术以胶原蛋白培养基作为表皮层和间质层的胶合介质，可以促进人生物工程角膜的神经内生长。本发明专利技术提供的全角膜或部分角膜，均具有良好的光学特性，手术后，患者全部恢复视力；并且角膜具有稳定的生化特性，无晚期角膜溶解，良好的生物相容性，无排斥反应。

A method of bio engineering cultivation of eye full layer cornea

The invention relates to the field of cell culture, in particular to a method of cultivating the whole cornea of the eye by bioengineering. The corneal layers are cultured respectively. The advantage of the invention is that when the patient does not need a complete corneal transplantation, it only needs to cultivate the corneal layer needed by the patient. The preparation method of the full angle membrane provided in the present invention is that the seed cells of the corneal epidermis and the interstitial layer are autologous cells, and the corneal endothelial cells are derived from the donor and can be cultured to get a large number of endothelial cells to avoid the limited source of donor. The collagen medium is used as a bonding medium between the epidermal layer and the interstitial layer, and it can promote the growth of human biological engineering cornea. The whole cornea or part of the cornea provided by the invention has good optical properties. After surgery, all the patients recover their eyesight; and the cornea has stable biochemical characteristics, no late cornea dissolution, good biocompatibility and no rejection.

【技术实现步骤摘要】
一种生物工程培育眼全层角膜的方法
本专利技术涉及细胞培养领域，具体而言，涉及一种生物工程培育眼全层角膜的方法。
技术介绍
角膜疾病是目前世界上发病率高，由于治疗手段有限，因此是致盲的主要原因之一。目前治疗角膜疾病的主要方法是全角膜或板层角膜移植。由于受到角膜合格供体来源缺乏的限制，绝大部分因角膜疾病失明或部分丧失视力的患者得不到有效的治疗。近十年来，生物组织工程技术的发展为体外构建生物角膜提供了技术可能，生物反应器更好的模拟了人体内的生存环境，利用种子细胞和支架材料的方式可以体外制备组织工程角膜；同时，很多技术在动物异种角膜脱细胞处理后可以给临床提供其他的选择。目前国内形成产业化的就是角膜基质层的生产，如猪眼角膜基质层脱细胞处理。但是，这只是角膜中部的一个层，也是生物组织工程技术最成熟的部分。大部分病人需要角膜内皮层或角膜前深部板层(角膜表皮层和角膜基质层)，因此全角膜或角膜内皮层，角膜前深部板层(角膜表皮层和角膜基质层)的生物工程培养是治疗因角膜疾患失明患者的重要一环，特别是角膜内皮层的培养，构建。其他组织工程技术以异类或异体细胞为种子细胞，在支架上培植全层生物角膜，这不仅提高了感本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种胶原蛋白培养基的制备方法，其特征在于，胶原蛋白溶液与缓冲液混合，然后加入EDC溶液和NHS溶液，调节pH为5.4‑5.6后，固化，然后采用10±2mM PBS洗脱得到；其中，EDC、NHS和胶原蛋白的3‑胺基团的摩尔量比例为3：2.8‑3.5：2.8‑3.5。

【技术特征摘要】
1.一种胶原蛋白培养基的制备方法，其特征在于，胶原蛋白溶液与缓冲液混合，然后加入EDC溶液和NHS溶液，调节pH为5.4-5.6后，固化，然后采用10±2mMPBS洗脱得到；其中，EDC、NHS和胶原蛋白的3-胺基团的摩尔量比例为3：2.8-3.5：2.8-3.5。2.根据权利要求1所述的胶原蛋白培养基的制备方法，其特征在于，所述胶原蛋白溶液的浓度为13.7w/w％±0.5w/w％，所述缓冲液为MES缓冲液，优选地，所述MES缓冲液的浓度为0.625±0.05M；进一步地，所述MES缓冲液与所述胶原蛋白溶液的体积为1:0.8-1.5；优选地，所述EDC溶液和NHS溶液为EDC和NHS的混合液，所述混合液中，EDC的浓度为200±5mg/ml，NHS的浓度为120±5mg/ml，所述混合液的溶剂为0.625±0.05M的MES缓冲液；进一步地，所述固化前还包括：混合液放入模具，然后置于95％-100％湿度的室温下放置15-18h；进一步地，所述固化的温度为37±2℃；进一步地，所述洗脱后得到的水凝胶样培养基浸入含有青霉素和链霉素以及1％±0.1％氯仿的10±1mMPBS中，2-10℃保存。3.权利要求1或2所述的胶原蛋白培养基的制备方法制得的胶原蛋白培养基；进一步地，所述胶原蛋白培养基的表面铺上羊膜，然后在所述羊膜的表面涂覆N-异丙基聚合物。4.一种眼角膜表皮层的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：口腔粘膜组织制得口腔粘膜上皮细胞的单细胞悬浮液；所述单细胞悬浮液接入权利要求3所述的胶原蛋白培养基上，并在接种的单细胞的外围放入T3T饲养细胞和丝裂霉素C，用以分泌生长激素和细胞因子；培养得到角膜上皮层。5.根据权利要求4所述的眼角膜表皮层的培养方法，其特征在于，所述口腔粘膜组织采用分散酶II处理，去除上皮层后，收集得到上皮细胞，用消化液处理，得到所述口腔粘膜上皮细胞的单细胞悬浮液；进一步地，所述分散酶II的浓度为2.8-3.5mg/ml，采用所述分散酶II于37±2℃下处理50-70min；进一步地，所述消化液为质量浓度为0.2％-0.3％的胰蛋白酶与质量浓度为0.005％-0.015％的EDTA的混合溶液，所述消化液处理的时间为12-18min；优选地，所述培养的温度为37±2℃，所述培养的时间为12-15天。6.一种眼角膜间质层的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：将大腿皮肤的真皮层，制得成纤维细胞单细胞；所述纤维细胞单细胞种植在不同的透明丝素蛋白膜，所述透明丝素蛋白酶均浸泡在含青霉素和链霉素的高糖DMEM培养液中，进行二维培养；不同的透明丝素蛋白膜重叠在一起，进行三维培养，得到角膜间质层。7.根据权利要求6所述的眼角膜间质层的培养方法，其特征在于，所述大腿皮肤为大腿内侧皮肤；优选地，所述大腿皮肤先进行预处理，所述预处理为清洗后去除血污并剪除结缔组织；进一步地，所述预处理后，进行消化处理，清洗后，去除表皮，将真皮切碎，胶原酶处理，孵育，经吹打后过滤，得到成纤维细胞单细胞；进一步地，所述消化处理为：皮肤浸泡在含有青霉素、链霉素和消化液的混合液，其中，青霉素的浓度为18-25U/ml，链霉素的浓度为18-25μg/ml，所述消化液中含有质量浓度为0.25％的胰蛋白酶和质量浓度为0.01％的EDTA，所述消化液的体积比占所述混合液的8％-15...

【专利技术属性】
技术研发人员：张辉，王旭，左岩霞，张兆蕾，
申请(专利权)人：山东麦德克斯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37