原代小胶质细胞/损伤神经元共培养体系及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了原代小胶质细胞/损伤神经元共培养体系及其构建方法和应用，所述体系包括原代小胶质细胞和损伤神经元，其中，损伤神经元被原代小胶质细胞吞噬于胞内；所述体系为体外共培养体系。本发明专利技术所述原代小胶质细胞/损伤神经元共培养体系较传统方法培养的静息小胶质细胞的不足，模拟神经损伤的微环境以激活小胶质细胞，保留了小胶质细胞的吞噬功能；本发明专利技术所述体系中的小胶质细胞能够被损伤神经元激活为巨噬细胞，增强其吞噬神经元碎片的能力；本发明专利技术所述方法构建的体系中原代细胞数量可观、性状稳定、活性较高，能够为后续的神经损伤或退变性疾病的基础研究提供可靠的共培养体系。

Primary microglia / injured neurons co culture system and its construction method and Application

The present invention discloses the primary microglia / injured neuron co culture system and its construction method and application. The system includes primary microglia and injured neurons, in which the injured neurons are phagocytic in the cell by the primary microglia; the system is a common culture system in vitro. The original microglia / injured neuron co culture system is more than the traditional method for the deficiency of resting microglia, simulates the microenvironment of nerve damage to activate microglia and preserves the phagocytosis of microglia, and the microglia in this system can be activated by damaged neurons. Macrophages, enhancing their ability to phagocyst the fragments of neurons, are constructed by the method described in this method, which can provide a reliable co culture system for the underlying research of subsequent nerve damage or degenerative disease.

【技术实现步骤摘要】
原代小胶质细胞/损伤神经元共培养体系及其构建方法和应用
本专利技术属于细胞生物学领域，涉及一种共培养体系，具体为原代小胶质细胞/损伤神经元共培养体系及其构建方法和应用。
技术介绍
脊髓损伤是严重影响身心健康的高致残性疾病，其治疗和康复的费用高、难度极大，给个人、家庭及社会均带来了沉重的负担，故一直为医学界研究的难点与热点。小胶质细胞是中枢神经系统(CNS)中巨噬细胞源性免疫调节细胞，脊髓损伤等神经病理性改变发生后，小胶质细胞迅速激活，调控免疫应答，清理细胞碎片，对损伤后CNS的微环境的调节具有重要意义。如何研究小胶质细胞在CNS微环境中的作用是进一步研究药物综合调控的关键。由于小胶质细胞占CNS细胞总量较少，故对于提取、纯化原代小胶质细胞存在一定难度。随着技术的发展及改革，提纯小胶质细胞的方法已经从传统的振荡、温和酶消化法等转向流式、磁珠分选等，只要条件许可，便能较为容易的分离到纯度较高的小胶质细胞。然而即使提纯到纯度较高的原代小胶质细胞，实验中亦常常面临着另一个重大问题，即该细胞纯化后增殖能力显著减弱，培养时细胞不断老化，数量不断减少，最终导致体外培养的失败。故而如何提纯、成功培养原代小胶质细胞，利于原代细胞进行实验，以获得更可靠的实验结果，依旧是科研中存在的难点之一。目前研究CNS中小胶质细胞的吞噬作用的方法国内外文献报道主要为体内研究，或单一小胶质细胞或细胞系对墨水或荧光微球等吞噬的体外研究，而未见体外原代小胶质细胞对损伤神经元的吞噬作用。这不仅不利于模拟脊髓损伤后的微环境，而且常导致提取的原代小胶质细胞不能很好地发挥吞噬作用，促进神经再生效果较差。因此，构建一种小胶质细胞/损伤神经元共培养体系，高效地激活小胶质细胞的吞噬作用，为进一步探索药物促进小胶质细胞吞噬作用及多靶点改善微环境显得尤为重要。
技术实现思路
解决的技术问题：为了克服现有技术的缺陷，获得一种能够高效激活小胶质细胞的吞噬作用，保证分离获得的细胞具有良好的细胞活性和分化能力，本专利技术提供了原代小胶质细胞/损伤神经元共培养体系及其构建方法和应用。技术方案：原代小胶质细胞/损伤神经元共培养体系，所述体系包括原代小胶质细胞和损伤神经元，其中，损伤神经元被原代小胶质细胞吞噬于胞内；所述体系为体外共培养体系。所述的原代小胶质细胞/损伤神经元共培养体系的构建方法，包括以下步骤：第1步、小胶质细胞分离a、无菌条件下分离新生一周内的SD大鼠脑皮质剪碎，胰酶消化15min；b、终止消化，加入完全培养基缓慢吹打，静置后吸取上清；2000r/min×2min离心1次，弃上清，完全培养基重悬接种；4h及24h后更换培养基，之后每2-3天更换一次培养基；c、取步骤b培养15d后的细胞，吸取原培养基并保留，润洗后加入DMEM/F12稀释的胰酶孵育25-40分钟，终止消化，胰酶浓度为0.05％～0.0625％；d、小心吸去未贴壁细胞或细胞碎片，加入混合培养基继续培养；第2步、原代神经元分离、培养、构建神经元损伤模型e、无菌条件下分离18d胎鼠海马体剪碎，培养箱中胰酶消化15min，血清终止消化；f、加入完全培养基均匀吹打、移取上清，离心后接种于含2％B27的完全培养基；g、4h后更换培养基，加入阿糖胞苷培养，阿糖胞苷的干预浓度为8～12μM，24h后更换培养基；h、取步骤g培养7-12d的神经元，润洗后加入含谷氨酸的DMEM/F12干预30min，谷氨酸的干预浓度为100μM，换新鲜含B27的完全培养基继续培养24h；i、取步骤h的细胞经AnnexinV-FITC/PI双染流式检测鉴定神经元凋亡；第3步、小胶质细胞/损伤神经元共培养体系j、取步骤d培养1-2d后的小胶质细胞鉴定，取步骤g培养7-12d神经元鉴定，按步骤h制备神经元损伤模型k、取步骤d中培养1-2d后的小胶质细胞，取步骤j的损伤神经元，接种于含小胶质细胞的培养板混合培养，形成原代小胶质细胞/损伤神经元共培养体系。优选的，完全培养基的组分为DMEM/F1275～90％，胎牛血清10～25％；混合培养基为新鲜完全培养基和原培养基按1:1混合。优选的，步骤i中神经元凋亡率为(23.9±2.5)％。优选的，步骤j中小胶质细胞和神经元细胞的纯度均≥95％。优选的，步骤k中接种体系小胶质细胞密度与损伤神经元密度为10:1。以上所述的原代小胶质细胞/损伤神经元共培养体系在促进神经再生中的应用。优选的，原代小胶质细胞/损伤神经元共培养体系中加入促进神经再生的药物含药血清培养后，小胶质细胞吞噬率增高50％～400％，吞噬率增高50％～400％，神经元一级突起数量增加50％～160％，神经元一级突起平均长度增加100％～200％。本专利技术所述原代小胶质细胞/损伤神经元共培养体系的工作原理在于：在该共培养体系下，以损伤的神经元激活原代小胶质细胞的吞噬功能，基于该共培养体系，可以通过观察小胶质细胞的吞噬指数以及损伤神经元再生突触的数量和长度等指标，来评价促进神经再生药物的体外干预效果。有益效果：(1)本专利技术所述原代小胶质细胞/损伤神经元共培养体系较传统方法培养的静息小胶质细胞的不足，模拟神经损伤的微环境以激活小胶质细胞，保留了小胶质细胞的吞噬功能；(2)本专利技术所述体系中的小胶质细胞能够被损伤神经元激活为巨噬细胞，增强其吞噬神经元碎片的能力；(3)本专利技术所述方法构建的体系中原代细胞数量可观、性状稳定、活性较高，能够为后续的神经损伤或退变性疾病的基础研究提供可靠的共培养体系。附图说明图1是分离培养的静息状态的小胶质细胞显微图，其中a是分离24h的小胶质细胞；b是分离15d纯化后的小胶质细胞；图2是分离培养的神经元显微图，其中a是分离24h后的神经元，b是分离48h后的神经元，c是分离96h后的神经元，d是分离10d后的神经元；图3是神经元和小胶质细胞免疫荧光染色鉴定图，其中a是神经元的βIIITubμLin骨架蛋白染色，b是小胶质细胞的CD11b蛋白染色，c是神经元的dapi核染色，d是小胶质细胞的dapi核染色，e是神经元的merge图片，f是小胶质细胞的merge图片；图4是神经元AnnexinV-FITC/PI双染流式检测结果图，其中，a为对照组，b为加入谷氨酸损伤模型组；图5是“脊髓康”对共培养体系中小胶质细胞吞噬神经元碎片功能的影响图，其中a是阴性对照组，b是“脊髓康”低剂量组，c是“脊髓康”中剂量组，d是“脊髓康”高剂量组，e是阳性对照组，f是吞噬百分率，g是吞噬指数；图6“脊髓康”干预共培养体系中存活神经元的生长情况图，其中a是阴性对照组，b是“脊髓康”低剂量组，c是“脊髓康”中剂量组，d是“脊髓康”高剂量组，e是阳性对照组，f是以及突起数量，g是一级突起平均长度。具体实施方式以下实施例进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术的限制。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1原代小胶质细胞/损伤神经元共培养体系，所述体系包括原代小胶质细胞和损伤神经元，其中，损伤神经元被原代小胶质细胞吞噬于胞内；所述体系为体外共培养体系。所述的原代小胶质细胞/损伤神经元共培养体系的构建方法，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.原代小胶质细胞/损伤神经元共培养体系，其特征在于，所述体系包括原代小胶质细胞和损伤神经元，其中，损伤神经元被原代小胶质细胞吞噬于胞内；所述体系为体外共培养体系。

【技术特征摘要】
1.原代小胶质细胞/损伤神经元共培养体系，其特征在于，所述体系包括原代小胶质细胞和损伤神经元，其中，损伤神经元被原代小胶质细胞吞噬于胞内；所述体系为体外共培养体系。2.权利要求1所述的原代小胶质细胞/损伤神经元共培养体系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：第1步、小胶质细胞分离a、无菌条件下分离新生一周内的SD大鼠脑皮质剪碎，胰酶消化15min；b、终止消化，加入完全培养基缓慢吹打，静置后吸取上清；2000r/min×2min离心1次，弃上清，完全培养基重悬接种；4h及24h后更换培养基，之后每2-3天更换一次培养基；c、取步骤b培养15d后的细胞，吸取原培养基并保留，润洗后加入DMEM/F12稀释的胰酶孵育25-40分钟，终止消化，胰酶浓度为0.05％～0.0625％；d、小心吸去未贴壁细胞或细胞碎片，加入混合培养基继续培养；第2步、原代神经元分离、培养、构建神经元损伤模型e、无菌条件下分离18d胎鼠海马体剪碎，培养箱中胰酶消化15min，血清终止消化；f、加入完全培养基均匀吹打、移取上清，离心后接种于含2％B27的完全培养基；g、4h后更换培养基，加入阿糖胞苷培养，阿糖胞苷的干预浓度为8～12μM，24h后更换培养基；h、取步骤g培养7-12d的神经元，润洗后加入含谷氨酸的DMEM/F12干预30min，谷氨酸的干预浓度为100μM，换新鲜含B27的完全培养基继续培养24h；i、取步骤h的细胞经AnnexinV-FITC/PI...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭杨，潘娅岚，马勇，周龙云，苑文超，郑苏阳，黄桂成，王磊，
申请(专利权)人：南京中医药大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32