【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于纳米制剂，具体涉及一种冰片修饰精准递药的人参融合型囊泡及其制备方法和应用法。
技术介绍
1、胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme，gbm)是一种原发性的恶性脑肿瘤，约占成人所有恶性脑肿瘤的50％，预后差，复发率高，死亡率高。gbm的治疗方式有手术切除、放射治疗和化学治疗等，但由于gbm呈弥漫性生长，手术切除后易复发，化疗和放疗不具有肿瘤特异性靶向，创伤范围广，全身毒性高等缺陷，限制了脑胶质瘤的疗效。血脑屏障(blood brain barrier，bbb)阻碍大部分的药物进入脑部，导致病灶部位有效药物浓度低，缺乏主动靶向和跨越bbb的能力极大地限制了化疗药物在胶质瘤的治疗。同时，gbm存在的治疗挑战还与脑胶质瘤细胞增殖迅速、侵袭广泛、高度耐药性和分子发病机制认识不足有关。因此，设计一种克服bbb和增加局部药物浓度的药物递送系统以实现精准靶向递送药物、避免剂量限制性全身不良反应、发挥治疗作用尤为重要。
2、砒霜是一种中药矿物药，主要成分为三氧化二砷(arsenic trioxide，ato)。在19世纪70年代，张亭栋制备中药砒霜注射液治疗白血病，并专利技术“癌灵一号”。目前，ato已被美国食品药品监督管理局通过成为治疗急性早幼粒白血病治疗的临床一线用药。在脑胶质瘤治疗方面，ato通过诱导坏死性凋亡和铁死亡、阻断细胞周期以及增强放疗和化疗的效果等多种机制来发挥其抗癌作用。但是，由于ato易被肾脏快速清除，其短半衰期、血脑屏障穿透性差、低靶向性、高度的亲水性等缺陷造成了其临床治疗的失
3、人参为“百草之王”，味甘微寒，具大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津安神之功效，应用范围广泛。已经从鲜人参中提取出人参来源细胞外囊泡(ginseng-derivednanoparticles，gdnp)，并分别对gdnp和鲜人参的总rna和蛋白质进行组学分析，结果表明gdnp中的蛋白质和rna与鲜人参大体一致，且其具有磷脂双分子层结构，具有进一步开发为兼具治疗作用的药物载体的潜力。研究表明，gdnp中含有人参皂苷rg1、re、rg3和rb1等多种抗癌活性成分，如人参皂苷rg3能够激活癌细胞内质网应激及自噬，进而诱导肿瘤细胞免疫原性细胞死亡，人参皂苷rg1通过扰乱有丝分裂进程抑制癌细胞增殖。此外，gdnp可诱导肿瘤微环境(tumor microenvironment，tme)中肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associatedmacrophages，tams)极化为具有抗肿瘤作用的m1表型，增加细胞毒性t淋巴细胞浸润，使“冷肿瘤”转变为“热肿瘤”，改善机体免疫功能而起到抗肿瘤的作用。因此，将人参来源细胞外囊泡作为药物载体携带目标药物用于靶向治疗，既可利用其自身活性物质，又可主动或被动装载治疗药物起协同/互补作用。然而，人参来源细胞外囊泡缺乏对脑胶质瘤的靶向效应，仍需进一步的修饰与优化。
4、肿瘤细胞来源的外泌体(exosome，exo)对于tme的塑造发挥着重要的作用，其参与蛋白质、核酸和脂类等物质的细胞间交换、肿瘤迁移、肿瘤血管生成等多种生理病理过程。同其他exo一样，肿瘤细胞来源exo具有优异的载药能力，可以容纳疏水性和亲水性药物，具有延长血液循环半衰期以及高生物相容性等优点。其次，肿瘤细胞来源的exo与其起源细胞有相似的成分，具有同源靶向归巢效应，可作为靶向递药载体而无需靶向分子的修饰。此外，来源于肿瘤细胞的exo由于携带免疫刺激介质，参与肿瘤微环境的免疫调节，其可作为免疫佐剂和抗原应用于癌症疫苗中。然而，肿瘤细胞来源外泌体对肿瘤的发生发展的作用机制复杂，产率低且成本高。
技术实现思路
1、专利技术目的：针对上述技术问题，本专利技术目的是提供一种冰片修饰精准递药的人参融合型囊泡，另一目的是提供一种冰片修饰精准递药的人参融合型囊泡的制备工艺，将药物活性成分进行纳米化处理，同时对融合囊泡进行表面修饰，充分利用融合囊泡内部载体空间，发挥其精准靶向病灶部位的作用，实现化疗、免疫治疗的多模式治疗。本专利技术提供的冰片修饰精准递药的人参融合型囊泡，人参来源细胞外囊泡具有优越渗透性，同时其含有人参皂苷在内的多种有效成分，发挥免疫协同效应，促进胶质瘤微环境由“冷”转“热”；肿瘤细胞来源exo具有同源靶向归巢能力，能够实现药物在胶质瘤病位的精准递送；以两者为来源，构建融合囊泡，实现给药部位高效渗透，病灶部位精准靶向，相得益彰，共克鼻腔给药递送困境。此外，在融合囊泡表面修饰冰片，可提高载体的黏膜渗透性并实现脑胶质瘤的靶位浓集。到达病灶部位后，ato通过阻滞细胞周期，诱导坏死性凋亡等多种途径发挥化学治疗作用。随后，ato能够最大限度地提高肿瘤细胞的免疫原性细胞死亡效率，使得大量损伤相关分子模式暴露，激活抗原提呈细胞，进而促进cd8+t细胞等免疫细胞在肿瘤病灶处的浸润；此外，gdnp促进巨噬细胞向抑瘤m1表型极化，进而重塑肿瘤微环境，增敏免疫效应。gdnp与ato联用，化疗协同免疫治疗，在杀伤胶质瘤细胞的同时，共奏肿瘤免疫抑制微环境重编程之功，逆转脑胶质瘤免疫抑制微环境，防止脑胶质瘤复发。
2、技术方案：为了达到上述专利技术目的，本专利技术所采用的技术方案如下：
3、一种冰片修饰精准递药的人参融合型囊泡，所述融合囊泡是由人参来源细胞外囊泡与肿瘤细胞来源外泌体融合形成的融合囊泡作为外壳包载纳米形式的药物内核，进一步经过冰片修饰所形成的。
4、优选的，所述人参来源细胞外囊泡的制备方法包括如下步骤：将新鲜人参洗净，榨汁，通过差速离心去除细胞碎片及游离蛋白质聚集体，得到人参粗提液，于蔗糖梯度溶液条件下超速离心，后于碘克沙醇密度梯度离心中纯化，重悬，即得。
5、优选的，所述肿瘤细胞来源外泌体选自胶质瘤细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞来源外泌体中的一种或几种，但不局限于这些来源。
6、优选的，所述纳米形式的药物内核为共聚物及化疗药物、光敏剂、诊断试剂等构成的复合物。
7、进一步优选的，所述共聚物优选自聚乳酸-聚甘醇酸共聚物(plga)、甲基聚乙二醇(mpeg)、聚乳酸(pla)、聚三亚甲基碳酸酯(ptmc)、聚乙二醇甲醚-聚乳酸-聚甘醇酸共聚物(mpeg-plga)中的一种或几种，但不局限于这些物质；所述化疗药物选自三氧化二砷、替莫唑胺、紫杉醇、阿霉素、姜黄素、顺铂中的一种或几种，但不局限于这些物质；所述光敏剂选自protoporphyrin ix(ppix)、indocyanine green(icg)、chlorin e6(ce6)中的一种或几种，但不局限于这些物质。
8、本专利技术还提供了所述的冰片修饰精准递药的人参融合型囊泡的制备方法，主要包括：纳米形式的药物内核的制备，肿瘤细胞来源exo的提取及分离，人参来源细胞外囊泡的提取及分离，融合囊泡的制备，纳米形式的药物内核的荷载，冰片的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种冰片修饰精准递药的人参融合型囊泡，其特征在于，所述人参融合型囊泡是由融合囊泡包载纳米形式的药物内核，进一步经冰片修饰所形成的；所述融合囊泡为人参来源细胞外囊泡与肿瘤细胞来源外泌体的融合体。
2.根据权利要求1所述的冰片修饰精准递药的人参融合型囊泡，其特征在于，所述人参来源细胞外囊泡的制备方法包括如下步骤：将新鲜人参洗净，榨汁，通过差速离心去除细胞碎片及游离蛋白质聚集体，得到人参粗提液，于蔗糖梯度溶液条件下超速离心，最后在碘克沙醇密度梯度离心中纯化，重悬，即得。
3.根据权利要求1所述的冰片修饰精准递药的人参融合型囊泡，其特征在于，所述肿瘤细胞来源外泌体选自胶质瘤细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞来源外泌体中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的冰片修饰精准递药的人参融合型囊泡，其特征在于，所述纳米形式的药物内核为共聚物与化疗药物、光敏剂或诊断剂构成的纳米复合物。
5.根据权利要求4所述的冰片修饰精准递药的人参融合型囊泡，其特征在于，所述共聚物选自聚乙二醇甲醚-聚乳酸-聚甘醇酸共聚物(mPEG-PLGA)、聚乳酸-聚甘醇酸
6.权利要求1-5任一项所述的冰片修饰精准递药的人参融合型囊泡的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
7.根据权利要求6所述的冰片修饰精准递药的人参融合型囊泡的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述纳米形式的药物内核的制备方法，包括如下步骤：含药物的内水相制备，外水相制备，油相制备，初复乳形成，除游离，即得。
8.根据权利要求6所述的冰片修饰精准递药的人参融合型囊泡的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，以其中所包含的蛋白含量计，所述肿瘤细胞来源外泌体与人参来源细胞外囊泡的质量比为1:(1-5)；所述超声破碎的时间为5-10min。
9.根据权利要求6所述的冰片修饰精准递药的人参融合型囊泡的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述融合囊泡和载药内核质量比为5：(1-5)，所述超声时间为5-10min；所述共孵育时间为1-2h；步骤(6)中，所述融合囊泡与冰片的质量比为10:(1-3)。
10.权利要求1-5任一项所述的冰片修饰精准递药的人参融合型囊泡在制备抗肿瘤药物或治疗脑部疾病药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种冰片修饰精准递药的人参融合型囊泡，其特征在于，所述人参融合型囊泡是由融合囊泡包载纳米形式的药物内核，进一步经冰片修饰所形成的；所述融合囊泡为人参来源细胞外囊泡与肿瘤细胞来源外泌体的融合体。
2.根据权利要求1所述的冰片修饰精准递药的人参融合型囊泡，其特征在于，所述人参来源细胞外囊泡的制备方法包括如下步骤：将新鲜人参洗净，榨汁，通过差速离心去除细胞碎片及游离蛋白质聚集体，得到人参粗提液，于蔗糖梯度溶液条件下超速离心，最后在碘克沙醇密度梯度离心中纯化，重悬，即得。
3.根据权利要求1所述的冰片修饰精准递药的人参融合型囊泡，其特征在于，所述肿瘤细胞来源外泌体选自胶质瘤细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞来源外泌体中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的冰片修饰精准递药的人参融合型囊泡，其特征在于，所述纳米形式的药物内核为共聚物与化疗药物、光敏剂或诊断剂构成的纳米复合物。
5.根据权利要求4所述的冰片修饰精准递药的人参融合型囊泡，其特征在于，所述共聚物选自聚乙二醇甲醚-聚乳酸-聚甘醇酸共聚物(mpeg-plga)、聚乳酸-聚甘醇酸共聚物(plga)、甲基聚乙二醇(mpeg)、聚乳酸(pla)、聚三亚甲基碳酸酯(ptmc)中的一种或几种；所述化疗药物优选自三氧化二砷、替莫唑胺、紫杉醇、阿霉素、姜黄素、顺铂中的一种或几种；所述光敏剂选自protoporp...
【专利技术属性】
技术研发人员：王若宁，李金铬，郭雨苗，狄留庆，
申请(专利权)人：南京中医药大学，
类型：发明
国别省市：
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