一种草鱼垂体细胞体外培养方法技术

本发明专利技术一种草鱼垂体细胞体外培养方法，本发明专利技术采用的草鱼垂体细胞原代培养方法可重复性强，并且细胞很好的保持了草鱼垂体的原始功能，另外采用自己配制的培养基和草鱼血清替代商品化的液态培养基和胎牛血清，可以极大降低培养成本，适宜大规模培养，为研究鱼类垂体功能和神经内分泌学提供了细胞模型。

【技术实现步骤摘要】
一种草鱼垂体细胞体外培养方法
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种草鱼垂体细胞体外培养方法。
技术介绍
草鱼是我国养殖产量最大的大宗淡水鱼(2015年产量为568万吨)，在其养殖过程中面临的一个主要问题是种质资源严重退化，因此草鱼新品种的选育十分迫切。然而由于草鱼性成熟时间较长，雌鱼一般需要4-5年方能达到性成熟，严重制约了其良种选育的进程。因此，揭示调控草鱼性腺发育和性成熟启动的分子机制，在此基础上通过基因编辑技术缩短草鱼性成熟时间，对于加速草鱼育种进程具有重要的意义。与哺乳动物类似，鱼类性成熟启动和生殖能力的获得受“下丘脑-垂体-性腺(HPG)”轴的控制，其中垂体作为该生殖轴的中间环节，起到承上启下的作用。垂体是机体重要的内分泌腺，由生长激素(GH)细胞、促性腺激素激素(GtH)细胞、催乳素(PRL)细胞、甲状腺激素(TSH)细胞和促肾上腺皮质激素(ACTH)细胞等多种激素分泌细胞组成；下丘脑通过调控垂体中的各种激素的释放(生长激素、促性腺激素、泌乳素、甲状腺激素及促肾上腺激素)，参与鱼类生长、发育、生殖及渗透压调节等各种生命活动。因此研究鱼类垂体的具体功能，对于揭示鱼类生长和生殖调控机制具有重要的意义。采用体内注射的方法研究垂体功能会受到其他组织的影响，无法直接观察到鱼类垂体的具体功能；而体外细胞培养实验可以很好地解决这个问题，能够检测到下丘脑分泌的神经递质对垂体的直接调控作用。垂体细胞单层培养能够长时间保持细胞的活力和功能，被广泛应用于哺乳动物垂体功能的验证，而在鱼类中的相关研究才刚起步。本专利技术所采用的草鱼垂体细胞分离和原代培养技术，能够为揭示草鱼垂体在生殖、生长及免疫等方面的功能提供基础。鱼类细胞培养同哺乳动物细胞培养一样，包括原代培养和传代培养两个阶段。原代培养是指直接从动物的组织器官获得细胞所做的首次培养；传代细胞培养则是对体外生长的细胞进行扩大和继代。一般来说传代培养细胞随着传代次数的增多，会逐渐失去原代培养细胞的生理生化功能特性，而原代培养细胞仍然保留部分甚至全部同在体细胞一样的生理功能特性，细胞仍然保持高度的分化性以及功能性，因此，原代培养细胞被认为可以取代动物活体开展部分生命科学研究。就目前细胞培养的应用现状而言，原代细胞培养所应用的研究领域更为宽广，在某些研究领域如环境毒理学研究、鱼类生理学研究和遗传学研究等方面的作用更是传代培养的细胞所无法代替的。由于鱼类种类、年龄、不同组织器官的生理结构不同，不同细胞生活的内环境也千差万别，因此对于不同鱼类和同种鱼类不同器官材料的取材方法、培养方式以及培养条件也因细胞而异。在鱼类细胞原代培养中，垂体和脑等神经细胞是比较难培养的种类，因此在鱼类中也鲜有报道。草鱼垂体细胞的体外培养方法，申请人团队在1998年的一篇国外文档中报道过(Wong,1998)，不过之前的方法是仿照金鱼垂体细胞的分离方法，其培养基的配方也是按照金鱼的特性配制两种培养基，因此细胞产量和细胞活力方面都不是很高。本专利技术所采用的方法与二十年前的方法相比较，在培养基的配方方面结合草鱼自身的特性进行了进一步的改良，根据分离和培养过程中的不同阶段配置了WM、CM、PM和TM四种不同的培养基；另外，本专利技术还采用草鱼自身的血清替代胎牛血清，一方面草鱼血清更好保持了草鱼垂体细胞的活力，另一方面也极大降低了细胞培养的成本。最后，本方面对细胞分离和培养方法也进一步进行了改良，使得垂体细胞收获量和活力保持能力进一步得到了提高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种草鱼垂体细胞体外培养方法，方法简单，易行，所得原代细胞性能稳定，非常完好的保存了垂体细胞的分泌功能。为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：一种草鱼垂体细胞体外培养方法，包括下述步骤：(一)草鱼垂体细胞分离(1)健康新鲜草鱼垂体使用WM培养基清洗后，将垂体切成0.5～0.8mm的小块，WM培养基再次清洗去除血块和杂质；(2)取50-100mg胰蛋白酶溶解于10mlWM培养基中，将垂体小块置于胰蛋白酶溶液中，20-37℃水浴锅中消解；(3)吸去含有胰蛋白酶的WM培养基，加入含有2.0-5.0mg/ml胰蛋白酶抑制剂的WM培养基，室温静置中和未去除的胰蛋白酶；(4)吸去含有胰蛋白酶抑制剂的WM培养基，加入含有0.1-0.5mg/mlDNaseII的WM培养基，室温静置以消解细胞间的DNA连接；(5)吸去含有DNaseII的WM培养基，加入含有1.5～3.0mMEDTA的CM培养基摇晃或是静置后将培养基吸走；(6)将垂体碎片转移到新的离心管中，向管中加入CM培养基，使用吸管轻轻吹打垂体碎片，细胞被吹散，此时将上层细胞使用40-100μm孔径的细胞筛过滤后收集到离心管中；(7)对收集的细胞溶液，使用500-2000rpm常温下离心5-20分钟收集细胞；(8)使用PM培养基对细胞进行重悬并镜检；(二)草鱼垂体细胞培养(9)用PM培养基稀释细胞接种至细胞培养板；优选的，每孔接种2.5×106个垂体细胞；(10)将接种好的细胞置于细胞培养箱中培养，待细胞贴在细胞培养板底部，向每个孔中加入含有草鱼血清的PM培养基，使每孔中的草鱼血清终浓度为5-10％(体积分数)，置于细胞培养箱继续培养。(11)垂体细胞在含有5-10％草鱼血清的PM培养基中培养贴壁后，将培养基吸去，加入：A.含有5-15ng/ml碱性成纤维生长因子的NM培养基进行传代培养；或B.加入TM培养基培养后进行后续加药实验。以上所述方法中，优选的，步骤(11)中，当加入的是含有5-15ng/ml碱性成纤维生长因子的NM培养基进行传代培养时，每三天更换一次培养基；以上所述的方法中，优选的，步骤(11)中，当加入的是NM培养基培养后继续加药实验时，药物溶于TM培养基后，再与细胞一起孵育。所述的WM培养基配方包括：MEM:5.0-10.0mg/ml,HEPES:5.0-10.0mg/ml,NaHCO3:2.0-5.0mg/ml,BSA:2.0-5.0mg/ml,青霉素:50-100U/ml，链霉素：50-100μg/ml，其余为双蒸水；所述的CM培养基配方包括：M199:5.0-10.0mg/ml,HEPES:5.0-10.0mg/ml,NaHCO3:2.0-5.0mg/ml,青霉素:50-100U/ml，链霉素：50-100μg/ml，其余为双蒸水；所述的PM培养基配方包括:MEM:5.0-10.0mg/ml,NaHCO3:2.0-5.0mg/ml,HEPES:5.0-10.0mg/ml,青霉素:50-100U/ml，链霉素：50-100μg/ml，其余为双蒸水；所述的TM培养基配方包括:MEM:5.0-10.0mg/ml,NaHCO3:2.0-5.0mg/ml,HEPES:5.0-10.0mg/ml,BSA:1.0-3.0mg/ml,青霉素:50-100U/ml，链霉素：50-100μg/ml，其余为双蒸水；所述的NM培养基的配方包括：MEM:10.0-12.0mg/ml,NaHCO3:2.0-3.0mg/ml,HEPES:6.0-8.0mg/ml,青霉素:100-200U/ml，链霉素：100-200μg/ml，GlutaMaxSupplement:25-50μM，B27S本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种草鱼垂体细胞体外培养方法，包括下述步骤：（一）草鱼垂体细胞分离（1）健康新鲜草鱼垂体使用WM培养基清洗后，将垂体切成0.5~0.8mm的小块，WM培养基再次清洗去除血块和杂质；（2）取50‑100mg胰蛋白酶溶解于10ml WM培养基中，将垂体小块置于胰蛋白酶溶液中，20‑37°C水浴锅中消解；（3）吸去含有胰蛋白酶的WM培养基，加入含有2.0‑5.0mg/ml胰蛋白酶抑制剂的WM培养基，室温静置中和未去除的胰蛋白酶；（4）吸去含有胰蛋白酶抑制剂的WM培养基，加入含有0.1‑0.5mg/mlDNaseII的WM培养基，室温静置以消解细胞间的DNA连接；（5）吸去含有DNase II的WM培养基，加入含有1.5~3.0mM EDTA的CM培养基摇晃或是静置后将培养基吸走；（6）将垂体碎片转移到新的离心管中，向管中加入CM培养基，使用吸管轻轻吹打垂体碎片，细胞被吹散，此时将上层细胞使用40‑100 μm孔径的细胞筛过滤后收集到离心管中；（7）对收集的细胞溶液，使用500‑2000rpm常温下离心5‑20分钟收集细胞；（8）使用PM培养基对细胞进行重悬并镜检；（二）草鱼垂体细胞培养（9）用PM培养基稀释细胞接种至细胞培养板；优选的，每孔接种2.5×10...

【技术特征摘要】
1.一种草鱼垂体细胞体外培养方法，包括下述步骤：（一）草鱼垂体细胞分离（1）健康新鲜草鱼垂体使用WM培养基清洗后，将垂体切成0.5~0.8mm的小块，WM培养基再次清洗去除血块和杂质；（2）取50-100mg胰蛋白酶溶解于10mlWM培养基中，将垂体小块置于胰蛋白酶溶液中，20-37°C水浴锅中消解；（3）吸去含有胰蛋白酶的WM培养基，加入含有2.0-5.0mg/ml胰蛋白酶抑制剂的WM培养基，室温静置中和未去除的胰蛋白酶；（4）吸去含有胰蛋白酶抑制剂的WM培养基，加入含有0.1-0.5mg/mlDNaseII的WM培养基，室温静置以消解细胞间的DNA连接；（5）吸去含有DNaseII的WM培养基，加入含有1.5~3.0mMEDTA的CM培养基摇晃或是静置后将培养基吸走；（6）将垂体碎片转移到新的离心管中，向管中加入CM培养基，使用吸管轻轻吹打垂体碎片，细胞被吹散，此时将上层细胞使用40-100μm孔径的细胞筛过滤后收集到离心管中；（7）对收集的细胞溶液，使用500-2000rpm常温下离心5-20分钟收集细胞；（8）使用PM培养基对细胞进行重悬并镜检；（二）草鱼垂体细胞培养（9）用PM培养基稀释细胞接种至细胞培养板；优选的，每孔接种2.5×106个垂体细胞；（10）将接种好的细胞置于细胞培养箱中培养，待细胞贴在细胞培养板底部，向每个孔中加入含有草鱼血清的PM培养基，使每孔中的草鱼血清终浓度为5-10%，置于细胞培养箱继续培养；（11）垂体细胞在含有5-10%草鱼血清的PM培养基中培养贴壁后，将培养基吸去，加入：A.含有5-15ng/ml碱性成纤维生长因子的NM培养基进行传代培养；或B.加入TM培养基培养后进行后续加药实验；所述的WM培养基配方包括：MEM:5.0-10.0mg/ml,HEPES:5.0-10.0mg/ml,NaHCO3:2.0-5.0mg/ml,BSA:2.0-5.0mg/ml,青霉素:50-100U/ml，链霉素：50-100μg/ml，其余为双蒸水；所述的CM培养基配方包括：M199:5.0-10.0mg/ml,HEPES:5.0-10.0mg/ml,NaHCO3:2.0-5.0mg/ml,青霉素:50-100U/ml，链霉素：50-100μg/ml，其余为双蒸水；所述的PM培养基配方包括:MEM:5.0-10.0mg/ml,NaHCO3:2.0-5.0mg/ml,HEPES:5....

【专利技术属性】
技术研发人员：呼光富，刘香江，秦向锋，黄安林，高洁芸，叶城，肖亚倩，魏开建，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42