一种用于人神经系统细胞培养和人多能性干细胞向神经系统细胞分化的营养添加剂技术方案

本发明专利技术公开一种用于人神经系统细胞培养和人多能性干细胞向神经系统细胞分化的营养添加剂，所述营养添加剂组成成分和最终使用浓度分别为：人胰岛素0.1‑20mg/L、维生素C 10‑200mg/L、谷胱甘肽10‑100mg/L、亚麻酸0.05‑5mg/L、肉毒碱0.2‑20mg/L、N‑乙酰半胱氨酸5‑500μM、乙醇胺0.01‑10mg/L、亚油酸0.05‑5mg/L。本发明专利技术还公开了上述营养添加剂在培养人神经系统细胞和诱导人多能性干细胞向神经系统细胞分化上的应用。本发明专利技术营养添加剂配方简单，成本低廉，化学成分明确，不含动物源性成分，不含蛋白提取物和水解物，批次之间均一稳定，更加安全。

A nutrient additive for cell culture of human neural system and differentiation of human pluripotent stem cells into neural cells

The invention discloses a system for human neural cell cultures and human pluripotent stem cells into neural cell differentiation of nutritional additives, the nutritional composition of additives and end use concentration respectively: 0.1 human insulin 20mg/L and vitamin C 10 200mg/L, Gu Guanggan 100mg/L, peptide 10 linolenic acid 0.05 5mg/L carnitine, 0.2 20mg/L, N acetylcysteine 5 500 M, 0.01 10mg/L, ethanolamine 0.05 linoleic acid 5mg/L. The invention also discloses the application of the nutritional additives in the differentiation of human neural system cells and inducible human pluripotent stem cells to the neural cell cells. The nutritional additive has simple formulation, low cost, clear chemical composition, no animal derived ingredients, no protein extracts and hydrolysates, and is stable and safe among batches.

【技术实现步骤摘要】
一种用于人神经系统细胞培养和人多能性干细胞向神经系统细胞分化的营养添加剂
本专利技术涉及细胞培养
更具体地，涉及一种用于人神经系统细胞培养和人多能性干细胞向神经系统细胞分化的营养添加剂。
技术介绍
各种神经损伤和退行性的神经系统疾病的发病率呈逐年上升趋势，传统的医学方法很难彻底治愈这类疾病，细胞替代性治疗是彻底治愈这类疾病潜在的最有效的手段。人多能性干细胞具有无限的增殖能力和分化为人体内各种类型体细胞的潜能，是细胞替代性治疗的理想的种子资源细胞。在一定的诱导条件下，人多能性可以分化成神经干细胞、各种类型的神经前体细胞、神经元、星型胶质细胞和少突角质细胞，为神经系统的损伤类疾病和退行性疾病的细胞替代性治疗源源不断地提供细胞。目前，在人多能性干细胞分化为神经系统细胞的过程中，在神经干细胞、神经前体细胞和神经元等的培养过程中，科研工作者基本上都采用了无血清培养基，即基础培养基加营养添加剂，基础培养基负责提供细胞生长必须的无机盐、维生素、氨基酸、葡萄糖、有机物等物质，营养添加剂负责提供细胞生长必须的蛋白、激素、微量元素等成分。目前，使用的最多的营养添加剂是商售的N2和B27。其中N2成分简单，只能满足人多能性干细胞分化为神经干细胞的过程。人多能性干细胞分化为各种类型的神经前体细胞和神经元，神经干细胞、神经前体细胞和神经元等的培养需要用到营养成分更丰富的B27。但是B27成分复杂，含有动物提取蛋白牛血清白蛋白，不仅会导致批次之间不稳定性，还有引进潜在的动物源性病毒的风险，为细胞替代性治疗带来潜在的安全隐患。为了使无血清培养基添加剂更加安全，批次之间更为稳定，在去除动物或者人提取蛋白方面，科学家做了大量的努力，并且取得了一些成果(如专利CN107119010A和CN106282114A)。但是在去除血清白蛋白的同时，为了达到相同的培养效果，CN107119010A添加了化学成分不明确的香蕉皮提取物，CN106282114A用到了化学成分不明确的人参提取物人参皂苷，不仅使添加剂的成分变得相对复杂，而且也存在批次之间稳定性难以控制的问题。因此，需要提供一种新型的用于人神经系统细胞培养和人多能性干细胞向神经系统细胞分化的营养添加剂。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种新型的用于人神经系统细胞培养和人多能性干细胞向神经系统细胞分化的营养添加剂，该营养添加剂配方简单，成本低廉，化学成分明确，不含动物源性成分，不含蛋白提取物和水解物。本专利技术的另一个目的在于提供一种上述营养添加剂在培养人神经系统细胞和诱导人多能性干细胞向神经系统细胞分化上的应用。为达到上述目的，本专利技术采用下述技术方案：本专利技术提供了一种用于人神经系统细胞培养和人多能性干细胞向神经系统细胞分化的营养添加剂，所述营养添加剂包括以下组成成分：人胰岛素、维生素C、谷胱甘肽、亚麻酸、肉毒碱、N-乙酰半胱氨酸、乙醇胺和亚油酸；其中，各组成成分的最终使用浓度分别为：人胰岛素0.1-20mg/L、维生素C10-200mg/L、谷胱甘肽10-100mg/L、亚麻酸0.05-5mg/L、肉毒碱0.2-20mg/L、N-乙酰半胱氨酸5-500μM、乙醇胺0.01-10mg/L、亚油酸0.05-5mg/L。优选的，所述营养添加剂的各组成成分的最终使用浓度分别为：人胰岛素0.5-15mg/L、维生素C20-100mg/L、谷胱甘肽20-90mg/L、亚麻酸0.1-4mg/L、肉毒碱0.5-15mg/L、N-乙酰半胱氨酸10-400μM、乙醇胺0.05-8mg/L、亚油酸0.1-4mg/L。最优选的，所述营养添加剂的各组成成分的最终使用浓度分别为：人胰岛素1-10mg/L、维生素C30-80mg/L、谷胱甘肽30-80mg/L、亚麻酸1-3mg/L、肉毒碱1-10mg/L、N-乙酰半胱氨酸50-100μM、乙醇胺0.1-5mg/L、亚油酸1-3mg/L。所述人神经系统细胞可以为神经干细胞、神经元、神经前体细胞、胶质细胞等。本专利技术所述营养添加剂的制备按照本专利技术常规方法进行制备；在本专利技术具体的实施方式中，在百级无菌环境中配制营养添加剂中各组成成分的最终使用浓度浓缩100倍的浓储液，使用时将100×营养添加剂的浓储液按比例添加到基础培养基中。本专利技术进一步提供了上述营养添加剂在培养人神经系统细胞和诱导人多能性干细胞向神经系统细胞分化上的应用。进一步，所述应用为所述营养添加剂配合基础培养基使用。进一步，所述基础培养基为DMEM/F12medium、Neurobasalmedium中一种或两种；优选的为，体积比为1:1的DMEM/F12medium和Neurobasalmedium。进一步，所述营养添加剂还可以配合促进人神经系统细胞生长的生长因子和/或小分子和促进人多能性干细胞向神经系统细胞分化的生长因子和/或小分子使用。其中，所述促进人神经系统细胞生长的生长因子为碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、上皮细胞生长因子(EGF)、胶质源神经营养因子(GDNF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、音猬因子(SHH)中的一种或几种的组合；所述促进人神经系统细胞生长的小分子为SHH信号通路激活相关小分子和视黄酸信号通路激活相关小分子。所述促进人多能性干细胞向神经系统细胞分化的生长因子为Wnt信号通路激活相关生长因子和SHH信号通路激活相关生长因子中一种或两种的组合；所述促进人多能性干细胞向神经系统细胞分化的小分子为TGFβ信号通路抑制相关小分子，Wnt信号通路激活相关小分子，SHH信号通路激活相关小分子，视黄酸信号通路激活相关小分子中的一种或几种的组合。具体的，所述营养添加剂可以配合碱性成纤维细胞生长因子和上皮细胞生长因子使用，用于培养人神经干细胞；所述人神经干细胞来源可以是体内分离培养获得的，诱导人多能性干细胞分化获得的、体细胞转分化获得的等。所述营养添加剂可以配合胶质源神经营养因子和脑源性神经营养因子使用，用于培养人神经元；所述人神经元的来源可以是体内分离培养获得的，诱导人多能性干细胞分化获得的、体细胞转分化获得的等。所述营养添加剂可以配合SHH信号通路激活剂(如小分子SAG、purmorphamine或生长因子音猬因子)和视黄酸信号通路激活剂(如视黄酸)使用，用于各种类型人神经前体细胞的培养；所述人神经前体细胞的来源可以是体内分离培养获得的，诱导人多能性干细胞分化获得的、体细胞转分化获得的等。所述营养添加剂可以配合TGFβ信号通路抑制相关小分子如SB431542、LDN193189等，Wnt信号通路激活相关小分子如CHIR99021、6-BIO等，SHH信号通路激活相关小分子如SAG、purmorphamine等，视黄酸信号通路激活相关小分子如视黄酸、Wnt信号通路激活相关生长因子如WNT3a和SHH信号通路激活相关生长因子如SHH等使用，用于诱导人多能性干细胞向人神经系统细胞分化。本专利技术通过实验证实，本专利技术营养添加剂不管在支持人神经系统细胞生长方面还是在支持人多能性干细胞向神经系统细胞分化方面，效果要好于目前报道的化学成分相对复杂的、含有人转铁蛋白、人血清白蛋白等蛋白提取物的营养添加剂。另外，如无特殊说明，本专利技术所用到的试剂、组分均可通过市售商购获得，如果没有特别说明，本专利技术所记载本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于人神经系统细胞培养和人多能性干细胞向神经系统细胞分化的营养添加剂，其特征在于，所述营养添加剂包括以下组成成分：人胰岛素、维生素C、谷胱甘肽、亚麻酸、肉毒碱、N‑乙酰半胱氨酸、乙醇胺和亚油酸；其中，各组成成分的最终使用浓度分别为：人胰岛素0.1‑20mg/L、维生素C 10‑200mg/L、谷胱甘肽10‑100mg/L、亚麻酸0.05‑5mg/L、肉毒碱0.2‑20mg/L、N‑乙酰半胱氨酸5‑500μM、乙醇胺0.01‑10mg/L、亚油酸0.05‑5mg/L。

【技术特征摘要】
1.一种用于人神经系统细胞培养和人多能性干细胞向神经系统细胞分化的营养添加剂，其特征在于，所述营养添加剂包括以下组成成分：人胰岛素、维生素C、谷胱甘肽、亚麻酸、肉毒碱、N-乙酰半胱氨酸、乙醇胺和亚油酸；其中，各组成成分的最终使用浓度分别为：人胰岛素0.1-20mg/L、维生素C10-200mg/L、谷胱甘肽10-100mg/L、亚麻酸0.05-5mg/L、肉毒碱0.2-20mg/L、N-乙酰半胱氨酸5-500μM、乙醇胺0.01-10mg/L、亚油酸0.05-5mg/L。2.根据权利要求1所述的营养添加剂，其特征在于，所述营养添加剂的各组成成分的最终使用浓度分别为：人胰岛素0.5-15mg/L、维生素C20-100mg/L、谷胱甘肽20-90mg/L、亚麻酸0.1-4mg/L、肉毒碱0.5-15mg/L、N-乙酰半胱氨酸10-400μM、乙醇胺0.05-8mg/L、亚油酸0.1-4mg/L。3.根据权利要求2所述的营养添加剂，其特征在于，所述营养添加剂的各组成成分的最终使用浓度分别为：人胰岛素1-10mg/L、维生素C30-80mg/L、谷胱甘肽30-80mg/L、亚麻酸1-3mg/L、肉毒碱1-10mg/L、N-乙酰半胱氨酸50-100μM、乙醇胺0.1-5mg/L、亚油酸1-3mg/L。4.一种如权利要求1-3任一所述的营养添加剂在培养人神经系统细胞上的应用。5.一种如权利要求1-3任一...

【专利技术属性】
技术研发人员：王娟，马静，辛文，
申请(专利权)人：北京全式金生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11