一种草鱼下丘脑细胞体外培养方法技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，具体公开了一种草鱼下丘脑细胞体外培养方法，本发明专利技术草鱼原代下丘脑细胞的纯化和培养方法，能够获得数量多、纯度高的原代下丘脑细胞，并且通过我们申请人配制的NM培养液能够明显提高所获得草鱼下丘脑细胞活力状况，该原代细胞培养方法可以为深入研究鱼类神经内分泌系统打下坚实基础。

A method for culture of grass carp hypothalamic cells in vitro

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【技术实现步骤摘要】
一种草鱼下丘脑细胞体外培养方法
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种草鱼下丘脑细胞体外培养方法。
技术介绍
草鱼作为我国养殖产量最大的淡水鱼(2015年产量为568万吨)，其在养殖过程中面临一个主要问题是种质资源严重退化，因此草鱼新品种的选育尤为迫切。然而由于草鱼性成熟时间较长，雌鱼一般需要4-5年方能达到性成熟，严重制约了其良种选育的的进程。因此揭示草鱼性成熟启动调控的分子机制，找出调节其性腺发育和性成熟启动的关键因子，在此基础上通过基因工程技术定向编辑关键因子缩短草鱼性成熟时间，对草鱼育种具有重要意义。鱼类的性成熟启动是受环境影响的。感觉器官把外界环境的刺激(如温度、光照和流水刺激等)传递到大脑，使下丘脑分泌促性腺激素释放激素(GnRH)，激发脑垂体分泌促性腺激素(LH&FSH)作用于性腺并促使性腺分泌性甾类激素，以促使性腺发育成熟及排卵排精。这其中下丘脑分泌的GnRH在鱼类性成熟启动过程中发挥着重要的作用，然而外界因子是如何调控下丘脑中GnRH表达的目前仍不清楚。鱼类下丘脑结构复杂，在体研究受到细胞间的相互作用和其他神经内分泌递质的影响，体外分离培养草鱼下丘脑细本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种草鱼下丘脑细胞体外培养方法，包括下述步骤：（1）将清洗干净的健康的新鲜草鱼下丘脑切成直径为0.5‑1.0 mm的碎片；（2）将切好的下丘脑碎片收集到离心管中，加入WM培养基清洗；（3）将清洗好的下丘脑碎片转移到一个新的离心管中，加入含有3‑8mg/ml trypsin 的WM培养基，20‑37°C水浴中消解；（4）将含有Trypsin的WM培养基吸去，然后加入含有2‑5 mg/ml Trypsin inhibitor的WM培养基；（5）将含有trypsin inhibitor的WM培养基吸去，加入含有0.1‑0.5mg/ml DNase II的WM培养基，室温静置以消解细胞间的DNA连接；...

【技术特征摘要】
1.一种草鱼下丘脑细胞体外培养方法，包括下述步骤：（1）将清洗干净的健康的新鲜草鱼下丘脑切成直径为0.5-1.0mm的碎片；（2）将切好的下丘脑碎片收集到离心管中，加入WM培养基清洗；（3）将清洗好的下丘脑碎片转移到一个新的离心管中，加入含有3-8mg/mltrypsin的WM培养基，20-37°C水浴中消解；（4）将含有Trypsin的WM培养基吸去，然后加入含有2-5mg/mlTrypsininhibitor的WM培养基；（5）将含有trypsininhibitor的WM培养基吸去，加入含有0.1-0.5mg/mlDNaseII的WM培养基，室温静置以消解细胞间的DNA连接；（6）吸去含有DNaseII的WM培养基，加入含有1.5~3.0mMEDTA的BM培养基摇晃或是静置后将培养基吸走；（7）将下丘脑碎片转移到新的离心管中，向管中加入BM培养基，使用吸管轻轻吹打下丘脑碎片，细胞被吹散，此时将上层细胞使用40-100μm孔径的细胞筛过滤后收集到离心管中；（8）将过滤出的细胞转移至新的离心管中，1000-3000rpm离心10-30min收集细胞；（9）将上层培养基去除，加入PM培养基重悬细胞；（10）取细胞悬浮液，加入台酚蓝染色后，显微镜下计数；（11）加入PM培养基将下丘脑细胞稀释，将细胞接种到细胞培养板中，每孔接种0.5-3.0×106cells，加入含有FBS的PM培养基，使得每孔中FBS的终含量为5-10%；；（12）下丘脑细胞在含有5-10%FBS的PM培养基中培养贴壁后，将培养基吸去，加入：含有5-15ng/ml碱性成纤维生长因子的NM培养基进行传代培养；或加入NM培养基培养后进行后续加药实验；所述的WM培养基的配方包括:MEM:10.0-12.0mg/ml,HEPES:6.0-8.0mg/ml,NaHCO3:2.0-3.0mg/ml,BSA:3.0-5.0mg/ml,青霉素:50-100U/ml，链霉素：50-100μg/ml;所述的BM培养基的配方包括:S-MEM:10.0-12.0mg/ml,HEPES:6.0-8.0mg/ml,NaHCO3:2.0-3.0mg/ml，BSA:3.0-5.0mg/ml，青霉素:50-100U/ml，链霉素：50-100μg/ml，所述的S-MEM为Ca2+freeMEM；所述的PM培养基的配方包括:MEM:10.0-12.0mg/ml,NaHCO3:2.0-3.0mg/ml,HEPES:6.0-8.0mg/ml,青霉素:100-200U/ml，链霉素：100-200μg/ml;所述的NM培养基的配方包括MEM:10.0-12.0mg...

【专利技术属性】
技术研发人员：呼光富，刘香江，秦向锋，叶城，黄安林，肖亚倩，魏开建，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42