一种施万细胞的提取纯化和培养方法技术

本发明专利技术公开了一种施万细胞的提取纯化和培养方法，该方法为选剪断臂丛神经和坐骨神经；再去除脊髓，从各个椎间孔抽取出周围神经；将所得周围神经进行消化制得单细胞悬液；然后扩增培养得到施万细胞，本发明专利技术方法从椎管椎间孔所抽取神经不含有神经外膜，成纤维细胞的残留量低。本方法从椎管椎间孔抽取出周围神经(包括臂丛神经，肋间神经和坐骨神经)，可以获得常规方法6‑8倍的神经量，且成纤维细胞的残留量明显降低，有利于施万细胞的培养和扩增。

【技术实现步骤摘要】
一种施万细胞的提取纯化和培养方法
本专利技术涉及一种施万细胞的提取纯化和培养方法。
技术介绍
原代培养的施万细胞不仅是研究施万细胞功能和周围髓鞘生物学的基础，也是神经组织工程的重要种子细胞。周围神经系统中的神经胶质细胞称施万细胞，它沿神经元的突起分布。施万细胞包裹在神经纤维上，这种神经纤维叫有髓神经纤维。有髓神经纤维和无髓神经纤维的施万细胞的形态和功能有所差异，施万细胞的外表面有基膜，能分泌神经营养因子，促进受损的神经元的存活及其轴突的再生，参与周围神经系统中神经纤维的构成。未成熟的施万细胞可以受到微环境的剌激而再次启动分化。在脊髓横断损伤、肌肉萎缩性侧面硬化病等疾病中一般会伴随有髓鞘的损伤。目前，研究人员已经摸索出诱导大鼠坐骨神经组织来源的施万细胞的培养方法(WangY,ZhouS,XuH,YanS,XuD,ZhangY.UpregulationofNF45correlateswithSchwanncellproliferationaftersciaticnervecrush.MolNeurosci.2015May；56(1):21627.)。但是现有技术中无论小鼠还是大鼠的施万细胞分离纯化和培养方法中均存在神经获取量低、且成纤维细胞残留量大的问题，最终不利于施万细胞的原代培养和扩增，所得施万细胞的数量少、活性差。
技术实现思路
为了解决上述存在的问题，本专利技术提供了一种施万细胞的提取纯化和培养方法。从新生SpragueDawly(SD)大鼠椎管椎间孔提取周围神经进行原代培养，获得稳定传代的高纯度施万细胞。本专利技术的目的在于提供一种施万细胞的提取纯化和培养方法。本专利技术所采取的技术方案是：一种施万细胞的分离纯化和培养方法，包括以下步骤：1)将消毒后的大鼠分离背部皮肤和肌肉；2)剪断臂丛神经和坐骨神经；3)剪开椎板露出脊髓；4)扯去脊髓；5)去除脊髓之后，能够看到各个节段的椎间孔，从各个椎间孔抽取出周围神经；6)剥离所得周围神经上残余的血管及结缔组织；7)将所得周围神经切割成小段，用含胰蛋白酶的消化液进行消化反应，研磨周围神经组织，制得单细胞悬液；8)将上步单细胞悬液过滤，取滤液，滤液再离心，取沉淀，用含FBS的DMEM/F12培养液重悬，将重悬液滴在用多聚赖氨酸氢溴酸处理过的培养皿中，24-26h后，加入含FBS和AraC的DMEM/F12培养液，混匀，45～50h后，用SC培养基替换含FBS和AraC的DMEM/F12培养液，继续扩增培养，即得施万细胞。进一步的，步骤1)中，在暴露神经的远心端神经分支处剪断臂丛神经和坐骨神经。进一步的，步骤5)中，所述周围神经包括臂丛神经、肋间神经和坐骨神经。进一步的，步骤6)中，剥离残余的血管及结缔组织是在HBSS溶液浸泡中进行剥离。进一步的，步骤7)中，周围神经切割成小段的长度为0.5～1mm。进一步的，步骤7)中，所述含胰蛋白酶的消化液为0.2％～0.3％胰蛋白酶-EDTA溶液。进一步的，步骤7)中，所述消化反应的温度为36.5～37.5℃，消化反应的时间为25～40min，且每隔8～12min震荡一次。进一步的，步骤8)中，所述离心的离心力为100～120g，时间为8～12min。进一步的，步骤8)中，所述含FBS和AraC的DMEM/F12培养液中FBS的浓度为9.5～10.5％w/v，AraC的浓度为9.5～10.5μM。进一步的，步骤8)中，所述SC培养基为含2.8～3.2％FBS、2.8～3.2μM毛喉素、9～11ng/ml重组人Heregulinβ-1以及0.8～1.2％青霉素/链霉素的DMEM/F12培养液。本专利技术的有益效果是：(1)本专利技术方法从椎管椎间孔所抽取神经不含有神经外膜，成纤维细胞的残留量低。(2)本专利技术方法与常规剪取坐骨神经培养法相比，本方法从椎管椎间孔抽取出周围神经(包括臂丛神经，肋间神经和坐骨神经)，可以获得常规方法6-8倍的神经量，且成纤维细胞的残留量明显降低，有利于施万细胞的培养和扩增。附图说明图1为分离大鼠周围神经的操作过程；图2为显微镜观察施万细胞形态(图2-A和图2-A’)、免疫荧光染色鉴定细胞表达施万细胞标志物S100(图2-B)、GFAP(图2-C)和P75(图2-D)蛋白、以及通过DAPI(图2-B’、2-C’、2-D’)对细胞核进行染色。具体实施方式一种施万细胞的分离纯化和培养方法，包括以下步骤：1)将消毒后的大鼠分离背部皮肤和肌肉；2)剪断臂丛神经和坐骨神经；3)剪开椎板露出脊髓；4)扯去脊髓；5)去除脊髓之后，能够看到各个节段的椎间孔，从各个椎间孔抽取出周围神经；6)剥离所得周围神经上残余的血管及结缔组织；7)将所得周围神经切割成小段，用含胰蛋白酶的消化液进行消化反应，研磨周围神经组织，制得单细胞悬液；8)将上步单细胞悬液过滤，取滤液，滤液再离心，取沉淀，用含FBS的DMEM/F12培养液重悬，将重悬液滴在用多聚赖氨酸氢溴酸处理过的培养皿中，24-26h后，加入含FBS和AraC的DMEM/F12培养液，混匀，45～50h后，用SC培养基替换含FBS和AraC的DMEM/F12培养液，继续扩增培养，即得施万细胞。优选的，步骤1)中，在暴露神经的远心端神经分支处剪断臂丛神经和坐骨神经。优选的，步骤5)中，所述周围神经包括臂丛神经、肋间神经和坐骨神经。优选的，步骤6)中，剥离残余的血管及结缔组织是在HBSS溶液浸泡中进行剥离。优选的，所述HBSS溶液为在1～7℃预冷的溶液。优选的，步骤7)中，周围神经切割成小段的长度为0.5～1mm。优选的，步骤7)中，所述含胰蛋白酶的消化液为0.2％～0.3％胰蛋白酶-EDTA溶液。优选的，步骤7)中，所述消化反应的温度为36.5～37.5℃，消化反应的时间为25～40min，且每隔8～12min震荡一次。优选的，步骤8)中，所述过滤用孔径为80～120μm的细胞过滤器进行过滤。优选的，步骤8)中，所述离心力为100～120g，时间为8～12min。优选的，步骤8)中，所述含FBS的DMEM/F12培养液中FBS的浓度为9.5～10.5％w/v。优选的，步骤8)中，所述含FBS和AraC的DMEM/F12培养液中FBS的浓度为9.5～10.5％w/v，AraC的浓度为9.5～10.5μM。优选的，步骤8)中，所述SC培养基为含2.8～3.2％FBS、2.8～3.2μM毛喉素、9～11ng/ml重组人Heregulinβ-1以及0.8～1.2％青霉素/链霉素的DMEM/F12培养液。下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明。本专利技术使用的化学物质材料为：新生SD大鼠(出生后2-4天，p2-4)；蒸馏水；75％乙醇；Hank的平衡盐溶液(HBSS)(ThermoFisherScientific，gibcotm，目录编号：c14175500bt)；多聚赖氨酸(PLL)氢溴酸(SigmaAldrich目录编号：p1274)；0.25％胰蛋白酶-EDTA(ThermoFisherScientific，gibcotm，目录编号：25200-072)；胎牛血清(FBS)(Corning，目录编号：35-076-cv)；DMEM/F12(Corning，目录编号：r10-092-cv)；阿糖胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种施万细胞的分离纯化和培养方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将消毒后的大鼠分离背部皮肤和肌肉；2)剪断臂丛神经和坐骨神经；3)剪开椎板露出脊髓；4)扯去脊髓；5)去除脊髓之后，能够看到各个节段的椎间孔，从各个椎间孔抽取出周围神经；6)剥离所得周围神经上残余的血管及结缔组织；7)将所得周围神经切割成小段，用含胰蛋白酶的消化液进行消化反应，研磨周围神经组织，制得单细胞悬液；8)将上步单细胞悬液过滤，取滤液，滤液再离心，取沉淀，用含FBS的DMEM/F12培养液重悬，将重悬液滴在用多聚赖氨酸氢溴酸处理过的培养皿中，24‑26h后，加入含FBS和AraC的DMEM/F12培养液，混匀，45～50h后，用SC培养基替换含FBS和AraC的DMEM/F12培养液，继续扩增培养，即得施万细胞。

【技术特征摘要】
1.一种施万细胞的分离纯化和培养方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将消毒后的大鼠分离背部皮肤和肌肉；2)剪断臂丛神经和坐骨神经；3)剪开椎板露出脊髓；4)扯去脊髓；5)去除脊髓之后，能够看到各个节段的椎间孔，从各个椎间孔抽取出周围神经；6)剥离所得周围神经上残余的血管及结缔组织；7)将所得周围神经切割成小段，用含胰蛋白酶的消化液进行消化反应，研磨周围神经组织，制得单细胞悬液；8)将上步单细胞悬液过滤，取滤液，滤液再离心，取沉淀，用含FBS的DMEM/F12培养液重悬，将重悬液滴在用多聚赖氨酸氢溴酸处理过的培养皿中，24-26h后，加入含FBS和AraC的DMEM/F12培养液，混匀，45～50h后，用SC培养基替换含FBS和AraC的DMEM/F12培养液，继续扩增培养，即得施万细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，在暴露神经的远心端神经分支处剪断臂丛神经和坐骨神经。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)中，所述周围神经包括臂丛神经、肋间神经和坐骨神经。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6)中，剥...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭家松，文锦坤，王祥海，谭丹丹，李莉霞，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：广东,44