Taq DNA聚合酶单克隆抗体组合及其反应体系和应用制造技术

本发明专利技术公开了Taq DNA聚合酶单克隆抗体组合及其反应体系和应用。本发明专利技术首先公开了Taq DNA聚合酶单克隆抗体组合，该组合包括单克隆抗体4A8和单克隆抗体9B7。本发明专利技术进一步公开了上述抗体组合在降低Taq DNA聚合酶的非特异性扩增和/或保证Taq DNA聚合酶的热稳定性中的应用及包含上述组合的反应体系及试剂盒。本发明专利技术上述抗体组合及优化的反应液在低温度条件下能够充分封闭Taq DNA聚合酶的活性区域，有效降低非特异性扩增并保证酶的热稳定性，在扩增的循环数更高的条件下仍可有效维持酶活性的持久性。

【技术实现步骤摘要】
TaqDNA聚合酶单克隆抗体组合及其反应体系和应用
本专利技术涉及生物
更具体地，涉及一种TaqDNA聚合酶单克隆抗体组合及其反应体系和应用。
技术介绍
聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)技术被广泛应用于分子生物学实验中，在体外几小时就可以将1个DNA分子扩增109倍。PCR技术类似于双链DNA的天然复制过程，在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。DNA聚合酶是实现DNA复制的关键。TaqDNA聚合酶是一种从水生栖热菌(Thermusaquatcus)YT-1中分离得到的耐热的DNA聚合酶。PCR技术具有特异性强、灵敏度高、快速、简便及重复性好等特点。但是，这些耐热的DNA聚合酶在低温条件下，仍有一定聚合酶活性，当引物3’端少数几个碱基与非扩增目标区的模板DNA序列发生配对时，很容易产生非特异性的扩增以及产生引物二聚体。目前，可以通过很多途径来提高TaqDNA聚合酶的最适反应温度，达到热启动的目的，如通过物理隔绝法、化学修饰法、设计特殊的引物或者用基因工程的方法对酶进行突变和改造。对TaqDNA聚合酶进行改造是一种常用的方法，例如用基因工程的方法去除TaqDNA聚合酶N端278个氨基酸，并且进行E626K和I707L突变，使得酶的最适工作温度升高，提高了PCR反应的特异性，减少了非特异性的扩增。但是此方法对于酶的长期稳定性提升有限(MilkoB.Kermekchiev,AnatolyTzekovandWayneM.Barnes.Cold-sensitivemutantsofTaqDNApolymeraseprovideahotstartforPCR[J].NucleicAcidsResearch,2003,31(21):6139-6147.)。对TaqDNA聚合酶进行化学修饰而得到的AmpliTaqGold和HotstartTaq这两种酶，虽然可以降低PCR过程中的非特异性扩增，但这两种酶的激活需要经过95℃孵育5至15分钟且反应的最适pH需小于等于8.3，这样容易导致DNA的脱嘌呤和断裂，影响了酶的长期稳定性和保真性(Cheng,S.,Fodder,C.,Bames,W.M.andHiguchi,R.EffectiveamplificationoflongtargetsfromclonedinsertsandhumangenomicDNA[J].Proe.NatlAcad·Sci.,1994,91:5695-5699.Barnes,W.M.TipsandtricksforlongandaccuratePCR[J].TrendsBiochem·Sci,1994,19:342.)。利用TaqDNA聚合酶抗体或者抑制剂对酶活性区域进行封闭是比较有效的一种降低低温非特异扩增的方法。利用抑制剂的封闭方法应用并不广泛，包括核酸复合体、蛋白、小分子化合物等，但是这些抑制剂与酶的结合并不完全契合，稳定性不高，难以达到低温抑制聚合酶活性，高温分解，不再抑制聚合酶活性的理想效果(DeFranchisR,CrossNC,FoulkesNSandCoxTM.ApotentinhibitorofTaqpolymerasecopurifieswithhumangenomicDNA[J].NucleicAcidsRes.1988,16(21):10355.BélecL,AuthierJ,Eliezer-VanerotMC,PiédouilletC,MohamedASandGherardiRK.Myoglobinasapolymerasechainreaction(PCR)inhibitor:alimitationforPCRfromskeletalmuscletissueavoidedbytheuseofThermusthermophiluspolymerase[J].MuscleNerve.1998,21(8):1064-7.MizushinaY1,SugiyamaY,YoshidaH,HanashimaS,YamazakiT,KamisukiS,OhtaK,TakemuraM,YamaguchiT,MatsukageA,YoshidaS,SaneyoshiM,SugawaraFandSakagauchiK.Galactosyldiacylglycerol,amammalianDNApolymerasealpha-specificinhibitorfromaseaalga,Petaloniabingbamiae.BiolPharmBull.2001,24(9):982-7.)而利用抗体作为封闭剂可以与活性位点结合紧密，封闭效果较好，在低温条件下抗体结合能力稳定，高温条件抗体失活，TaqDNA聚合酶活性基团暴露，起到了良好的热启动的作用。有文献报道用TaqDNA聚合酶免疫实验动物获得抗TaqDNA聚合酶的单抗或者多抗(Scalice,E.R.,Sharkey,D.J.andDaiss,J.L.MonoclonalantibodiespreparedagainsttheDNApolymerasefromThermusaquaticusarepotentinhibitorsofenzymeactivity[J].Immunol.Methods,1994,172:147-163.Kellogg,D.E,Rybalkin,I.,Chen,S.,Mukhamedova,N.,Vlasik,T.,Siebert,P.D.andChenchik,A.TaqStartantibody：‘hotstart’PCRfacilitatedbyaneutralizingmonoclonalantibodydirectedagainstTaqDNApolymerase[J].Biotechniques,1994,16:1134-1137.Sharkey,D.JScalice,E.R.,Christy,K.G,Atwood,S,M,andDaiss,J.L.Antibodiesasthermolabileswitches:hightemperaturetriggeringforthepolymerasechainreaction[J]Biotechnology,1994,12:506-509.)。在反应中，低温下酶与抗体形成抗原抗体复合物，使得聚合酶暂时失活。在较高温度下时，抗体变性，使得TaqDNA聚合酶得以释放发挥活性，实现热启动PCR扩增。然而由于抗体筛选耗时耗力，难以筛选得到效果最佳的抗体，尽管可以在一定程度上降低非特异性扩增，但是由于体系内增加了抗体后，会造成聚合酶活性下降，酶长期稳定性受到影响，整体扩增能力下降，产物减少等问题。因此需要开发一种新型抗体封闭系统，最大程度降低TaqDNA聚合酶非特异性扩增、保证聚合酶长期热稳定性。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种TaqD本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种Taq DNA聚合酶单克隆抗体组合，其特征在于：所述Taq DNA聚合酶单克隆抗体组合包括单克隆抗体4A8和单克隆抗体9B7；/n所述单克隆抗体4A8含有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区均由决定簇互补区和框架区组成；所述重链可变区和轻链可变区的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.1第26-35位、SEQID NO.1第51-58位和SEQ ID NO.1第99-109位所示；所述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别为SEQ ID NO.2第24-40位、SEQ ID NO.2第54-60位和SEQ ID NO.2第93-101位所示；/n所述单克隆抗体9B7含有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区均由决定簇互补区和框架区组成；所述重链可变区和轻链可变区的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.5第26-35位、SEQID NO.5第51-58位和SEQ ID NO.5第98-110位所示；所述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别为SEQ ID NO.6第24-35位、SEQ ID NO.6第50-56位和SEQ ID NO.6第89-97位所示。/n...

【技术特征摘要】
1.一种TaqDNA聚合酶单克隆抗体组合，其特征在于：所述TaqDNA聚合酶单克隆抗体组合包括单克隆抗体4A8和单克隆抗体9B7；
所述单克隆抗体4A8含有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区均由决定簇互补区和框架区组成；所述重链可变区和轻链可变区的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQIDNO.1第26-35位、SEQIDNO.1第51-58位和SEQIDNO.1第99-109位所示；所述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别为SEQIDNO.2第24-40位、SEQIDNO.2第54-60位和SEQIDNO.2第93-101位所示；
所述单克隆抗体9B7含有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区均由决定簇互补区和框架区组成；所述重链可变区和轻链可变区的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQIDNO.5第26-35位、SEQIDNO.5第51-58位和SEQIDNO.5第98-110位所示；所述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别为SEQIDNO.6第24-35位、SEQIDNO.6第50-56位和SEQIDNO.6第89-97位所示。


2.根据权利要求1所述的TaqDNA聚合酶单克隆抗体组合，其特征在于：所述单克隆抗体4A8的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；
所述单克隆抗体9B7的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示。


3.根据权利要求1或2所述的TaqDNA聚合酶单克隆抗体组合，其特征在于：所述单克隆抗体4A8由保藏号为CGMCCNo.19191的鼠抗EasyTaqDNA聚合酶单克隆抗体细胞株4A8产生；
所述单克隆抗体9B7是由保藏号为CGMCCNo.18882的鼠抗EasyTaqDNA聚合酶单克隆抗体细胞株9B76产生。


4.权利要求1-3任一所述的TaqDNA聚合酶单克隆抗体组合...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹洋，李行，宋新文，张帅，耿亮，马静，辛文，
申请(专利权)人：北京全式金生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11