血清或血浆中的外泌体制备试剂盒及外泌体制备方法技术

本发明专利技术公开一种血清或血浆中的外泌体制备试剂盒及外泌体制备方法，所述试剂盒包括外泌体提取试剂，所述外泌体提取试剂为亲水聚合物或亲水聚合物的溶液；所述亲水聚合物包括PEG、硫酸葡聚糖、PVP中的一种或几种的组合，所述PEG的分子量为20,000‑1,200,000道尔顿，所述硫酸葡聚糖的分子量为5,000‑20,000道尔顿，所述PVP的分子量为10,000或40,000‑700,000道尔顿，利用该试剂盒得到的外泌体粒径分布更集中；本发明专利技术提供的外泌体制备方法还优化了外泌体纯化步骤，使得外泌体的杂质更少，纯度更高。

Kit for preparation of exosome in serum or plasma and method for preparation of exosome

The invention discloses an exosome preparation kit in serum or plasma and an exosome preparation method. The kit comprises an exosome extraction reagent, the exosome extraction reagent is a solution of a hydrophilic polymer or a hydrophilic polymer, and the hydrophilic polymer comprises one or several combinations of PEG, dextran sulfate and PVP. The molecular weight of the PEG is 20,000 1,200,000 Dalton, the molecular weight of the dextran sulfate is 5,000 20,000 Dalton, and the molecular weight of the PVP is 10,000 or 40,000 700,000 Dalton. The particle size distribution of the exosome obtained by the kit is more concentrated; the preparation method of the exosome provided by the invention also optimizes the exosome. The procedure of body purification makes the exosome less impurities and higher purity.

【技术实现步骤摘要】
血清或血浆中的外泌体制备试剂盒及外泌体制备方法
本专利技术涉及生物医药
更具体地，涉及一种血清或血浆中外泌体制备试剂盒及外泌体制备方法。
技术介绍
外泌体(Exosome)发现于1986年，是一种直径约30-150nm的双层脂膜囊泡状结构小体，可由机体内多种细胞如免疫细胞、干细胞、心血管细胞、网织红细胞、血小板、神经细胞和肿瘤细胞等主动分泌产生，广泛分布于外周血、尿液、唾液、乳汁、腹水、羊水等体液中。外泌体携带大量特异性的蛋白质(如细胞因子、生长因子)以及功能性的mRNA、miRNA等生物活性物质。目前人们多采用超速离心、免疫磁珠、超滤、沉淀或试剂盒等方法实现外泌体的提取分离。但是由现有技术的方法提取得到的外泌体，收率较低，颗粒范围大，且纯度不高，易含有与外泌体尺寸特征类似的蛋白质颗粒。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种高效的外泌体提取试剂。本专利技术的第二个目的在于提供一种血清或血浆中的外泌体制备试剂盒。本专利技术的第三个目的在于提供一种制备血清或血浆中外泌体的方法。为达到上述目的，本专利技术采用下述技术方案：根据上述第一个目的，本专利技术提供一种血清或血浆中的外泌体提取试剂，所述提取试剂为亲水聚合物或亲水聚合物的溶液；所述亲水聚合物包括PEG、硫酸葡聚糖、PVP中的一种或几种的组合；所述PEG的分子量为20,000-1,200,000道尔顿，所述硫酸葡聚糖的分子量为5,000-20,000道尔顿，所述PVP的分子量为10,000或40,000-700,000道尔顿。优选地，所述亲水聚合物的溶液为水溶液、盐溶液或有机溶液；所述亲水聚合物的总浓度为1-500mg/ml。优选地，所述亲水聚合物包括PEG和PVP中的至少一种与硫酸葡聚糖的组合，所述硫酸葡聚糖的浓度为1-250mg/ml，优选为10-150mg/ml，最优选为50-100mg/ml。优选地，所述亲水聚合物的溶液包括高分子物质，所述高分子物质包括单糖、二糖、多糖和蛋白质中的至少一种；所述亲水聚合物的溶液中高分子物质的浓度为0.01-50mg/ml。优选地，所述单糖为葡萄糖，二糖为蔗糖，多糖为糖原，蛋白质为碱性蛋白。根据上述第二个目的，本专利技术提供一种制备外泌体的试剂盒，包括如上任一项所述的外泌体提取试剂。优选地，所述试剂盒还包括纯化微球，所述纯化微球包括琼脂糖珠，所述琼脂糖珠与有机基团进行了偶联。优选地，所述琼脂糖珠包括ProteinA，ProteinG，ProteinL，Bluebeads6FF、丁基-琼脂糖凝胶4B、DEAE-琼脂糖凝胶CL-6B中的一种或几种的组合。优选地，所述试剂盒还包括外泌体溶解试剂。本专利技术还提供一种如上任一项所述的试剂盒在制备分离外泌体或外泌体类似双层脂膜囊泡中的应用。根据上述第三个目的，本专利技术还提供一种血清或血浆中的外泌体制备方法，包括以下步骤：向血清或血浆中加入1/4倍体积至1倍体积的外泌体提取试剂，混匀后静置，离心去除上清，得到外泌体沉淀；向所述外泌体沉淀中加入外泌体溶解试剂，得到外泌体溶解液；向所述外泌体溶解液中加入纯化微球，静置后离心，收集上清即为高纯度外泌体。优选地，还包括向血清或血浆中加入ProteinaseK进行预处理的步骤。本专利技术的有益效果如下：本专利技术提供一种独特的外泌体提取试剂配方，使得沉淀下来的囊泡的粒径范围更窄，外泌体粒径分布更集中，富集的非目标双层囊泡结构的小泡更少；且在沉降后，本专利技术还优化了外泌体的纯化工艺，利用纯化微球去除掉沉降下来的血清或者血浆中的杂质蛋白颗粒，使得通过本方法制备的外泌体更容易获得高质量的电镜图像，Westernblot检测实验中可获得更加特异性的条带，减少非特异性物质的干扰，且能确保外泌体的活性。附图说明下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细的说明。图1示出本专利技术试验例1中得到的外泌体粒径测试结果图；图2示出本专利技术试验例1中得到的外泌体两次粒径测试结果平均值分布图；图3示出本专利技术试验例2中得到的外泌体电镜图；图4示出本专利技术试验例3中不同配比的纯化微球纯化效果考马斯亮蓝染色图；图5本专利技术试验例3中交叉实验考马斯亮蓝染色图；图6示出本专利技术试验例4中得到的外泌体Westernblot检测结果图；图7示出本专利技术试验例5中得到的外泌体细胞迁移距离统计结果图；图8示出试验例5两次细胞迁移实验的统计结果图；图9示出试验例6的qPCR统计结果图；图10示出试验例7中正常人和结直肠癌患者血清中外泌体的miR-19a的qPCR结果比较图。具体实施方式现有技术如SBI公司专利号为US9005888B2的专利中公开一种血清血浆中外泌体的分离方法，主要是利用亲水聚合物聚乙二醇(PEG)、硫酸葡聚糖和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等单一一种或者几种组合的成分作为聚成物，进行沉降后离心收集，其后没有纯化步骤或者只有简单纯化，导致得到的外泌体提取物存在很多不足。首先，其沉降下来的双层脂囊泡颗粒的粒径范围约10～400nm或者更大，包含有太多不同种类的其他非外泌体同性质的囊泡。其次，其沉降下来的外泌体中含有大量的非外泌体的、血清或者血浆中存在的各类蛋白质颗粒，导致获得的外泌体纯度很低，具体体现为电镜实验中杂质点多，且电镜图片不干净，Westernblot实验中非特异性信号多，甚至可以严重干扰检测，出现假阳性或假阴性条带等。而且，上述的诸多不确定性导致利用该方法沉降下来的外泌体的活性不明确。针对现有技术中存在的问题至少之一，本专利技术提供一种血清或血浆中的外泌体提取试剂，所述提取试剂为亲水聚合物或亲水聚合物的溶液；所述亲水聚合物包括PEG(聚乙二醇)、硫酸葡聚糖、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)中的一种或几种的组合；所述PEG的分子量为20,000-1,200,000道尔顿，例如，具体可以为35,000道尔顿，50,000道尔顿，100,000道尔顿，200,000道尔顿，300,000道尔顿，400,000道尔顿，600,000道尔顿，900,000道尔顿，1000,000道尔顿，2000,000道尔顿，4000,000道尔顿，5000,000道尔顿，8000,000道尔顿等。所述硫酸葡聚糖的分子量为5,000-20,000道尔顿，例如，具体可以为5,000道尔顿，9,000道尔顿，15,000道尔顿，20,000道尔顿等。所述PVP的分子量为10,000或40,000-700,000道尔顿，例如，具体可以为10,000道尔顿，55,000道尔顿，360,000道尔顿等。本专利技术中的外泌体提取试剂可以应用于血清/血浆中的外泌体提取，也可以应用于血清/血浆类似体液中的外泌体提取，所述血清/血浆类似体液可以为具有血清/血浆类似生理组成或者人体或动物体循环系统内能和血液相互转换的体液，如：尿液或胸腔积液或脊髓液或脑脊髓液或唾液或乳液或关节液或精液或阴道液或羊水或细胞上清。本专利技术通过筛选亲水聚合物的最优分子量范围，提供一种具有独特配方的外泌体提取试剂，利用该提取试剂进行血清或血浆中的外泌体提取，可以使得提取到的外泌体粒径分布更集中，可以解决现有技术的方法中存在的沉降下来的双层脂膜囊泡结构颗粒范围过大而导致的包含过多非外泌体及其同性质囊泡的问题，有利于后续的电镜实验或其它检测实验的进行。优选地，所述亲水聚合物的溶液本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种外泌体提取试剂，其特征在于，所述提取试剂为亲水聚合物或亲水聚合物的溶液；所述亲水聚合物包括PEG、硫酸葡聚糖、PVP中的一种或几种的组合；所述PEG的分子量为20,000‑1,200,000道尔顿，所述硫酸葡聚糖的分子量为5,000‑20,000道尔顿，所述PVP的分子量为10,000或40,000‑700,000道尔顿。

【技术特征摘要】
2018.06.04 CN 20181056369901.一种外泌体提取试剂，其特征在于，所述提取试剂为亲水聚合物或亲水聚合物的溶液；所述亲水聚合物包括PEG、硫酸葡聚糖、PVP中的一种或几种的组合；所述PEG的分子量为20,000-1,200,000道尔顿，所述硫酸葡聚糖的分子量为5,000-20,000道尔顿，所述PVP的分子量为10,000或40,000-700,000道尔顿。2.根据权利要求1所述的外泌体提取试剂，其特征在于，所述亲水聚合物的溶液为水溶液、盐溶液或有机溶液；所述亲水聚合物的总浓度为1-500mg/ml。3.根据权利要求1所述的外泌体提取试剂，其特征在于，所述亲水聚合物包括PEG和PVP中的至少一种与硫酸葡聚糖的组合，所述硫酸葡聚糖的浓度为1-250mg/ml，优选为10-150mg/ml，最优选为50-100mg/ml。4.根据权利要求2所述的外泌体提取试剂，其特征在于，所述亲水聚合物的溶液包括高分子物质，所述高分子物质包括单糖、二糖、多糖和蛋白质中的至少一种；所述亲水聚合物的溶液中高分子物质的浓度为0.01-50mg/ml。5.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：李晶，曹洋，马静，辛文，
申请(专利权)人：北京全式金生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11