抗肌酸激酶同工酶抗体及其制备方法、应用、氨基酸序列技术

本发明专利技术涉及免疫学技术领域，具体公开了一种抗肌酸激酶同工酶抗体及其制备方法、应用、氨基酸序列，包括：一重链之可变区的氨基酸序列，包括SEQ ID NO：1的序列；以及一轻链之可变区的氨基酸序列，包括SEQ ID NO：2的序列，所述SEQ ID NO：1之序列与SEQ ID NO：2之序列具有至少一取代。本发明专利技术具有特异性高、亲和力强的特点。

【技术实现步骤摘要】
抗肌酸激酶同工酶抗体及其制备方法、应用、氨基酸序列
本专利技术涉及免疫学
，特别涉及一种抗肌酸激酶同工酶抗体及其制备方法、应用、氨基酸序列。
技术介绍
肌酸激酶(CreatineKinase,CK)(ATP:CreatineN-phosphotransferaseEC2.7.3.2)又名磷酸肌酸激酶(CreatinePhosphokinase,CPK),通常存在于动物的心脏、肌肉以及脑等组织的细胞浆和线粒体中，它能可逆性地催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应，是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶。肌酸激酶是由两个亚基组成的二聚体蛋白，根据组织分布的部位和亚基组成的不同可分为肌肉型(M)、脑型(B)、杂化型(MB)和线粒体型(Mt)四种同功酶形式。肌肉型肌酸激酶分子是由两个相同的亚基(MM型)组成的同源二聚体，主要存在于各种肌肉细胞中，BB型同源二聚体主要存在于脑细胞中，MB型异源二聚体主要存在于心肌细胞中，MM型主要存在于心肌和骨骼肌线粒体中。不同的同工酶的增高意义并不完全一样。肌肉型(MM)的增高通常是肌病的表现,杂化型(MB)的增高与心肌损害有关，这对于诊断心肌梗塞有比较重要的意义。肌酸激酶同工酶(CKMB)主要存在于心肌，在诊断急性心肌梗死上是一种很有效的指标。若患者具有CKMB活性升高和下降的序列性变化，且峰值超过参考值上限2倍，又无其他原因可解释时，应考虑急性心肌梗塞(AMI)。CKMB质量(CKMBmass)用于心梗的诊断时，所用诊断界值推荐为正常人参考数值上限的99％分位。CKMB胸痛发作3h后的诊断急性心肌梗塞(AMI)阳性率可达50％，6h的诊断阳性率可达到80％。急性心肌梗塞(AMI)发作后如未进行溶栓治疗，CKMB通常在3～8h出现升高，达峰时在发病后9～30h，于48～72h恢复至正常水平。与总CK测定比较，CKMB的峰时稍有提前，且消失也较快。由于诊断窗较窄，临床上可利用这一点对再梗死进行诊断。分析临床和实验性心肌梗死后血清CK及其同工酶CKMB和梗死区与非梗死区心肌内CKMM、CKMB含量变化表明：梗死后48h或72h内血清CK、CKMB呈升高、高峰、下降的动态规律，它们敏感地反映了损伤心肌内酶释放过程。血清CKMB不受横纹肌损伤因素影响，胸痛发作后72h内可诊断急性心肌梗塞(AMI)；对诊断急性心肌梗塞(AMI)入院后再次心梗具有很高的特异性(98％)。溶栓治疗时，CKMB早期升高及短时间内达峰是急性心肌梗塞(AMI)的征兆。下壁急性心肌梗塞(AMI)在治疗2h后CKMB增加2.2倍以上，前壁急性心肌梗塞(AMI)在治疗2h后增加2.5倍以上，均提示心肌出现再灌注。因此如果能开发出一种特异性高、亲和力强的抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体，将其应用于临床诊断急性心肌梗塞，可以极大地提高急性心肌梗塞的救治成功率；然而目前并没有。
技术实现思路
本专利技术为了解决现有临床诊断急性心肌梗塞所存在的上述技术问题，提供了一种特异性高、亲和力强的抗肌酸激酶同工酶抗体及其制备方法、应用、氨基酸序列。本专利技术的第一种技术方案：抗肌酸激酶同工酶抗体的氨基酸序列，包括一重链之可变区的氨基酸序列，包括SEQIDNO：1的序列；以及一轻链之可变区的氨基酸序列，包括SEQIDNO：2的序列，所述SEQIDNO：1之序列与SEQIDNO：2之序列具有至少一取代。作为优选，所述取代选自下组，所述SEQIDN0：1之第12个氨基酸由亮氨酸取代为精氨酸，所述SEQIDNO：1之第20个氨基酸由亮氨酸取代为异亮氨酸，取代之后得到的重链为SEQIDN0：3；所述SEQIDNO：2之第6个氨基酸由谷氨酰胺取代为天冬氨酸，所述SEQIDNO：2之第12个氨基酸由丝氨酸取代为苏氨酸，所述SEQIDNO：2之第22个氨基酸由苏氨酸取代为蛋氨酸，取代之后得到的轻链为SEQIDN0：4；且所述抗体与肌酸激酶同工酶结合。作为优选，所述取代选自下组，所述SEQIDN0：1之第11个氨基酸由甲硫氨酸取代为色氨酸，所述SEQIDNO：1之第24个氨基酸由苯丙胺酸取代为脯氨酸，取代之后得到的重链为SEQIDN0：5；所述SEQIDNO：2之第13个氨基酸由丙氨酸取代为天冬氨酸，所述SEQIDNO：2之第21个氨基酸由甲硫氨酸取代为精氨酸，所述SEQIDNO：2之第42个氨基酸由丝氨酸取代为谷氨酸,取代之后得到的轻链为SEQIDN0：6；且所述抗体与肌酸激酶同工酶结合。作为优选，所述取代选自下组，所述SEQIDN0：1之第22个氨基酸由半胱氨酸取代为丝氨酸，所述SEQIDNO：1之第50个氨基酸由亮氨酸取代为谷氨酸，取代之后得到的重链为SEQIDN0：7；所述SEQIDNO：2之第35个氨基酸由丙氨酸取代为天冬氨酸，所述SEQIDNO：2之第35个氨基酸由酪氨酸取代为甘氨酸，所述SEQIDNO：2之第68个氨基酸由苏氨酸取代为色氨酸,取代之后得到的轻链为SEQIDN0：8；且所述抗体与肌酸激酶同工酶结合。本专利技术的第二种技术方案：抗肌酸激酶同工酶抗体，包括氨基酸序列。本专利技术的第三种技术方案：抗肌酸激酶同工酶抗体的制备方法，包括以下步骤，(A)获取可变区基因；(B)使用全基因合成手段将测序合格的可变区基因序列插入到重轻链表达质粒中；(C)将表达质粒转化到感受态细胞中；(D)从复苏细菌中提取去内毒素的表达质粒；(E)选用HEK293细胞，并对HEK293细胞进行传代培养；(F)瞬时转染HEK293细胞；(G)重组抗体纯化。作为优选，所述步骤(A)中的获取包括以下步骤，(A1)设计重链引物和轻链引物，并进行相应免疫球蛋白G基因序列的合成；(A2)从杂交瘤细胞总RNA逆转录模版中钓取抗肌酸激酶同工酶抗体可变区基因；(A3)将钓取出来的基因序列插入T载体后测序。作为优选，所述步骤(A1)中，选取与肌酸激酶同工酶结合的单克隆抗体之轻链可变区氨基酸序列与重链可变区氨基酸序列，所述轻链可变区氨基酸序列中包括SEQIDNO：2之序列，所述重链氨基酸序列可包括SEQIDNO：1之序列，根据SEQIDNO：2之序列和SEQIDNO：1之序列可变区的V基因和CH区、CL区的保守序列特征，分别设计重链引物和轻链引物，并利用杂交瘤细胞进行相应免疫球蛋白G基因序列的合成。作为优选，所述步骤(A2)中的钓取包括以下步骤，(A21)取一个0.2mL的离心管，在离心管中分别加入10μL的5хTaqBuffer试剂、4μL的dNTPMixture(10mMeach)试剂、1μL的杂交瘤细胞总RNA逆转录模版、5μL的重链引物、5μL的轻链引物、24.75μL的ddH20试剂和0.25μL的TaqDNApolymerase(5u/μL)试剂，然后将离心管中的混合物振荡混匀后，放置在离心机上离心；(A22)将步骤(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.抗肌酸激酶同工酶抗体的氨基酸序列，其特征是：包括/n一重链之可变区的氨基酸序列，包括SEQ ID NO：1的序列；以及/n一轻链之可变区的氨基酸序列，包括SEQ ID NO：2的序列，/n所述SEQ ID NO：1之序列与SEQ ID NO：2之序列具有至少一取代。/n

【技术特征摘要】
1.抗肌酸激酶同工酶抗体的氨基酸序列，其特征是：包括
一重链之可变区的氨基酸序列，包括SEQIDNO：1的序列；以及
一轻链之可变区的氨基酸序列，包括SEQIDNO：2的序列，
所述SEQIDNO：1之序列与SEQIDNO：2之序列具有至少一取代。


2.根据权利要求1所述的抗肌酸激酶同工酶抗体的氨基酸序列，其特征是：所述取代选自下组，
所述SEQIDN0：1之第12个氨基酸由亮氨酸取代为精氨酸，所述SEQIDNO：1之第20个氨基酸由亮氨酸取代为异亮氨酸，取代之后得到的重链为SEQIDN0：3；
所述SEQIDNO：2之第6个氨基酸由谷氨酰胺取代为天冬氨酸，所述SEQIDNO：2之第12个氨基酸由丝氨酸取代为苏氨酸，所述SEQIDNO：2之第22个氨基酸由苏氨酸取代为蛋氨酸，取代之后得到的轻链为SEQIDN0：4；
且所述抗体与肌酸激酶同工酶结合。


3.根据权利要求1所述的抗肌酸激酶同工酶抗体的氨基酸序列，其特征是：所述取代选自下组，
所述SEQIDN0：1之第11个氨基酸由甲硫氨酸取代为色氨酸，所述SEQIDNO：1之第24个氨基酸由苯丙胺酸取代为脯氨酸，取代之后得到的重链为SEQIDN0：5；
所述SEQIDNO：2之第13个氨基酸由丙氨酸取代为天冬氨酸，所述SEQIDNO：2之第21个氨基酸由甲硫氨酸取代为精氨酸，所述SEQIDNO：2之第42个氨基酸由丝氨酸取代为谷氨酸,取代之后得到的轻链为SEQIDN0：6；
且所述抗体与肌酸激酶同工酶结合。


4.根据权利要求1所述的抗肌酸激酶同工酶抗体的氨基酸序列，其特征是：所述取代选自下组，
所述SEQIDN0：1之第22个氨基酸由半胱氨酸取代为丝氨酸，所述SEQIDNO：1之第50个氨基酸由亮氨酸取代为谷氨酸，取代之后得到的重链为SEQIDN0：7；
所述SEQIDNO：2之第35个氨基酸由丙氨酸取代为天冬氨酸，所述SEQIDNO：2之第35个氨基酸由酪氨酸取代为甘氨酸，所述SEQIDNO：2之第68个氨基酸由苏氨酸取代为色氨酸,取代之后得到的轻链为SEQIDN0：8；
且所述抗体与肌酸激酶同工酶结合。


5.抗肌酸激酶同工酶抗体，其特征是...

【专利技术属性】
技术研发人员：李因来，戚跃明，王玮，
申请(专利权)人：杭州博岳生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33