抗人脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了抗Lp‑PLA2单克隆抗体及其应用，所公开的抗Lp‑PLA2单克隆抗体，具有良好的稳定性和特异性，能够作为制备Lp‑PLA2诊断试剂的关键原料，且具有抗脂蛋白和同族蛋白干扰的能力，与脂蛋白结合或与PLA2同族蛋白混合都不会影响检测结果。采用该单克隆抗体可开发出特异性好、准确度高的诊断检测试剂盒，能够成功检测出健康人与心血管疾病患者血清中Lp‑PLA2的区别，特别是在阿尔兹海默症患者血清中存在PLA2同族蛋白干扰的情况下，也能检测出正确结果。

【技术实现步骤摘要】
抗人脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体及其应用
本专利技术涉及生物医药
，具体涉及抗人脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体及其应用
技术介绍
脂蛋白相关磷脂酶A2(Lipoprotein-associatedphospholipaseA2(Lp-PLA2))，是一种炎性细胞分泌的能促使氧化磷脂水解的磷脂酶，是磷脂酶A2(PLA2)超家族中的一员，Lp-PLA2的基本功能是催化多种氧化磷脂Sn-2位上醋键水解，产生游离脂肪酸和溶血磷脂。此外，Lp-PLA2还能水解血小板活化因子等致炎因子。Lp-PLA2的浓度能够反映动脉粥样硬化斑块的形成及严重程度，因此临床上用于预警心血管突发事件，评估冠心病、脑卒中的发生及复发风险。目前基于Lp-PLA2酶活性的检测试剂盒在临床上得到了广泛应用。但由于Lp-PLA2同家族的其它磷脂酶所具有的酶活性的干扰，以及受检测环境的影响等因素，使得酶法特异性不够高。同时由于酶法方法学的局限性使得酶法的检测灵敏度也不高。基于蛋白浓度测定的检测方法因为基于抗原抗体的特异性相互作用，所以检测特异性更高。但在临床使用对比中发现，基于酶活性的检测方法以及基于蛋白浓度的检测方法所得结果相关性较差。研究表明血液中的Lp-PLA2蛋白主要与富含载脂蛋白(Apo)B的脂蛋白结合。与Lp-PLA2结合的脂蛋白会掩盖Lp-PLA2上的抗体结合表位，直接干扰抗体与Lp-PLA2的特异性结合，从而使得检测结果不能反映Lp-PLA2的真实浓度。除此以外，对于阿尔兹海默症以及精神分裂症确诊的情况下，会伴随着大脑的氧化应激反应、炎症等状况出现，同时伴随PLA2G3或者PLA2G12A表达量的升高。这两种都是属于磷脂酶A2家族的成员，其升高会带来对Lp-PLA2诊断检测的干扰。并最终导致与酶法的检测结果相关性差。因此，能够耐受脂蛋白和其他磷脂酶A2家族的蛋白的特异性抗人Lp-PLA2的单克隆抗体，或抗体对，对于开发更精准更简便的心脑血管疾病检测试剂具有重要的应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供对人Lp-PLA2有高亲和力的抗体，该抗体能抗脂蛋白和同家族其他蛋白的干扰。本专利技术的目的之一在于提供一种分离的DNA分子，编码所述抗Lp-PLA2人源抗体的重链和/或轻链的可变区或全长氨基酸。抗人Lp-PLA2单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：a)如SEQIDNO:1所列的重链可变区CDR1；b)如SEQIDNO:2所列的重链可变区CDR2；c)如SEQIDNO:3所列的重链可变区CDR3；d)如SEQIDNO:4所列的轻链可变区CDR1；e)如SEQIDNO:5所列的轻链可变区CDR2；f)如SEQIDNO:6所列的轻链可变区CDR3；上述抗人Lp-PLA2单克隆抗体或其抗原结合部分，命名为LP-A或a)如SEQIDNO:7所列的重链可变区CDR1；b)如SEQIDNO:8所列的重链可变区CDR2；c)如SEQIDNO:9所列的重链可变区CDR3；d)如SEQIDNO:10所列的轻链可变区CDR1；e)如SEQIDNO:11所列的轻链可变区CDR2；f)如SEQIDNO:12所列的轻链可变区CDR3；上述抗人Lp-PLA2单克隆抗体或其抗原结合部分，命名为LP-B优选地，所述单克隆抗体LP-A或LP-B特异性结合人Lp-PLA2蛋白，结合位点位于PLA2G3或PLA2G12A蛋白的结合区域之外。优选地，所述单克隆抗体LP-A或LP-B结合位点位于脂蛋白结合区域之外。本专利技术另一方面提供一种Lp-PLA2的检测试剂盒，所述检测试剂盒含有上述单克隆抗体LP-A或LP-B。优选地，所述检测试剂盒利用LP-A和LP-B同时识别Lp-PLA2蛋白，测定Lp-PLA2蛋白浓度。本专利技术的另一方面提供一种结合物，包含与化学标记或生物标记共价连接的上述单克隆抗体。本专利技术还涉及一种偶联物，由上述单克隆抗体、和/或所述的结合物与固体介质或半固体介质偶联形成。本专利技术还涉及上述单克隆抗体、结合物或偶联物在制备检测LP-A或LP-B表达的产品中的应用。有益效果：本专利技术的单克隆抗体LP-A或LP-B都能够抗脂蛋白和磷脂酶A2同族蛋白的干扰，所以对Lp-PLA2有很高的亲和力，减少假阳性结果。在动物细胞中高效表达，可用于工业化生产。附图说明图1：重组蛋白Lp-PLA2纯化；图2：单克隆抗体的生产纯化；图3：单克隆抗体稳定性鉴定；图4：胶体金免疫层析标曲；图5：Lp-PLA2含量胶体金免疫层析抗脂蛋白干扰实验；图6：Lp-PLA2含量胶体金免疫层析抗同族蛋白干扰实验；图7：胶体金免疫比浊试剂盒标曲；图8：Lp-PLA2含量胶体金免疫比浊试剂盒抗脂蛋白干扰实验；图9：Lp-PLA2含量胶体金免疫比浊试剂盒抗同族蛋白干扰实验。具体实施方式以下通过特定的具体实例说明本专利技术的实施方式，本专利技术的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案。实施例仅例示性说明本专利技术的原理及其功效，而非用于限制本专利技术。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本专利技术的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属
中具有通常知识者在未脱离本专利技术所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本专利技术的权利要求所涵盖。实施例1：重组蛋白Lp-PLA2的表达纯化将人Lp-PLA2基因序列克隆至原核表达载体构建原核表达质粒，该表达质粒转化大肠杆菌BL21后用含有抗生素的LB平板培养。挑取单克隆接种至LB培养基。培养至菌液OD值达到0.6后，加入IPTG诱导蛋白的表达。诱导16小时之后离心收集菌液。菌体经破碎以后离心收集上清，并采用离子交换以及分子筛纯化得到抗原蛋白。如图1所示，泳道1：购买的Lp-PLA2蛋白；泳道2：本研究中表达纯化得到的Lp-PLA2抗原蛋白，结果显示市面上销售的Lp-PLA2蛋白，存在杂带，且有明显拖带情况，说明蛋白存在杂质，纯度不高，而本专利技术纯化的Lp-PLA2蛋白经SDS-PAGE电泳鉴定蛋白条带大小正确，与市面上销售的蛋白相比条带干净，无拖带和杂带的产生，纯度达到90％以上后，可用于单抗的制备。实施例2：小鼠免疫及抗体检测挑选5只6-8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠，将弗氏完全佐剂与浓度为2mg/ml的抗原蛋白按等体积混合并乳化。乳化好的抗原免疫6-8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠，采用脚底注射或背部皮下注射每只小鼠注射40μg抗原蛋白。初次免疫完成两周后，将抗原蛋白与弗氏不完全佐剂混合乳化，再次采用脚底注射或背部皮下注射每只小鼠注射40μg抗原蛋白。两周以后通过尾静脉采血，离心收集上清并用ELISA检测血清效价。每两周免疫一次并检测血清效价。2次免疫后，百万倍稀释后血清效价已高达2.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.抗人Lp-PLA2单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：/na)如SEQ ID NO:1所列的重链可变区CDR1；/nb)如SEQ ID NO:2所列的重链可变区CDR2；/nc)如SEQ ID NO:3所列的重链可变区CDR3；/nd)如SEQ ID NO:4所列的轻链可变区CDR1；/ne)如SEQ ID NO:5所列的轻链可变区CDR2；/nf)如SEQ ID NO:6所列的轻链可变区CDR3；/n上述抗人Lp-PLA2单克隆抗体或其抗原结合部分，命名为LP-A/n或/na)如SEQ ID NO:7所列的重链可变区CDR1；/nb)如SEQ ID NO:8所列的重链可变区CDR2；/nc)如SEQ ID NO:9所列的重链可变区CDR3；/nd)如SEQ ID NO:10所列的轻链可变区CDR1；/ne)如SEQ ID NO:11所列的轻链可变区CDR2；/nf)如SEQ ID NO:12所列的轻链可变区CDR3；/n上述抗人Lp-PLA2单克隆抗体或其抗原结合部分，命名为LP-B。/n

【技术特征摘要】
1.抗人Lp-PLA2单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：
a)如SEQIDNO:1所列的重链可变区CDR1；
b)如SEQIDNO:2所列的重链可变区CDR2；
c)如SEQIDNO:3所列的重链可变区CDR3；
d)如SEQIDNO:4所列的轻链可变区CDR1；
e)如SEQIDNO:5所列的轻链可变区CDR2；
f)如SEQIDNO:6所列的轻链可变区CDR3；
上述抗人Lp-PLA2单克隆抗体或其抗原结合部分，命名为LP-A
或
a)如SEQIDNO:7所列的重链可变区CDR1；
b)如SEQIDNO:8所列的重链可变区CDR2；
c)如SEQIDNO:9所列的重链可变区CDR3；
d)如SEQIDNO:10所列的轻链可变区CDR1；
e)如SEQIDNO:11所列的轻链可变区CDR2；
f)如SEQIDNO:12所列的轻链可变区CDR3；
上述抗人Lp-PLA2单克隆抗体或其抗原结合部分，命名为LP-B。


2.根据权利要求1所述的单克隆抗体LP-A或LP-B，...

【专利技术属性】
技术研发人员：易维京，蔡方琴，汤定斌，张艳军，张丽华，罗嘉，
申请(专利权)人：重庆中元汇吉生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆;50