全人源抗PCSK9抗体、其抗原结合片段及其应用制造技术

本发明专利技术公开了全人源抗PCSK9抗体或其抗原结合片段及其应用，本发明专利技术以人PCSK9为抗原从高容量全人源噬菌体抗体库中筛选出抗PCSK9单链抗体。然后，采用体外亲和力成熟、CDR区交叉克隆及抗体全长化技术获得新型、高活性、全人源抗PCSK9单链及全长抗体。上述抗体及其片段可特异性结合PCSK9,有效抑制PCSK9介导的肝细胞表面低密度脂蛋白受体(LDLR)的降解,显著增强肝细胞对低密度脂蛋白胆固醇(LDL‑C)的摄取，从而明显降低血清LDL‑C水平。本发明专利技术所述的抗体及其片段科应用于制备预防和治疗PCSK9介导的包括高胆固醇血症、高血脂症肥胖症、动脉粥样硬化以及心脑血管疾病等相关疾病的药物。

【技术实现步骤摘要】
全人源抗PCSK9抗体、其抗原结合片段及其应用
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种新的全人源抗前蛋白转化酶枯草溶菌素9(Proproteinconvertasesubtilisin/kexin9,PCSK9)抗体、其抗原结合片段及其医药用途。
技术介绍
心血管疾病(CVD)严重危害人类健康，而以血浆低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平升高为主要特征的高胆固醇血症可促进动脉粥样斑块形成，是诱发CVD的重要危险因素(NaturereviewsDiseaseprimers2017,3:17093)。人体血液中LDL-C的清除主要通过肝细胞表面低密度脂蛋白受体(LDLR)来完成，当LDL-C与LDLR结合后可形成LDL-C/LDLR复合物并进入溶酶体，LDL-C被降解后LDLR可重新回到细胞膜表面循环利用。前蛋白转化酶枯草溶菌素9(Proproteinconvertasesubtilisin/kexin9,PCSK9)是一种由692个氨基酸组成的糖蛋白，属前蛋白转化酶(proproteinconvertases,PCs)家族中的第九个成员。PCSK9是一种分泌型丝氨酸蛋白酶，主要在肝脏和肠道等组织中表达，然后释放到血液中(JBiolChem.2004；279(47):48865-48875；TrendsBiochemSci.2007；32(2):71-77)。PCSK9进入血液循环后可与肝细胞表面LDLR的表皮生长因子样结构域特异性结合，并引导其进入肝细胞到达溶酶体，使LDLR在溶酶体中降解，导致肝细胞表面LDLR减少，从而降低肝脏清除LDL-C的能力，最终导致血液中LDL-C水平升高及高胆固醇血症的发生(ProcNatlAcadSciUSA.2008；105(35):13045-13050；CirculationResearch.2014；114(6):1022-1036)。因此，抑制PCSK9合成、分泌以及阻断其与LDLR相互作用的药物均就可促进LDL-C清除，降低患高胆固醇血症风险(AnnuRevPharmacolToxicol.2014；54:273-293)。此外，有文献报道，PCSK9升高还与肥胖及2型糖尿病(PediatrDiabetes.2017.PMID:28093849,DOI:10.1111/pedi.12490；DiabetesMetabResRev.2016；32(2):193-199.)以及肾病综合症以及蛋白尿等慢性肾病(IntUrolNephrol.2017.PMID:28084558，DOI:10.1007/s11255-017-1505-2)密切相关，因此，抑制PCSK9也可防治这些与PCSK9异常升高相关的疾病。抗PCSK9抗体可特异性阻断PCSK9与LDLR的结合，抑制PCSK9介导的LDLR降解，提高肝细胞表面LDLR水平，从而增强肝细胞对LDL-C的清除功能。因此，抗PCSK9抗体的研发近年来备受瞩目。由美国Amgen公司开发的全人源单抗Evolocumab(AMG145)和Regeneron/Sanofi公司开发的全人源单抗Alirocumab(REGN727/SAR236553)已在美国和欧洲获批上市(JClinPharmacol.2017；57(1):7-32)，用于杂合子家族性高胆固醇血症的治疗，或他汀不能有效降低LDL-C的心血管高危者的治疗。噬菌体展示技术(phagedisplay)具有无需抗原免疫、筛选效率高、亲和力成熟方便的优点，目前已成为发现全人源抗体的主要技术平台。本专利技术以重组人PCSK9为抗原，从全人源噬菌体抗体库中筛选出抗人PCSK9单链抗体，然后通过体外亲和力成熟及CDR区交叉克隆(cross-cloning)技术(MolecularImmunology,2008,46(1):135-144)获得了新型、高活性、全人源抗人PCSK9抗体。该抗体具有免疫原性低、特异性强、活性高的优点，可用于诊断、预防和治疗PCSK9介导的高胆固醇血症、高血脂症、动脉粥样硬化、心脑血管疾病、非酒精性脂肪肝、肥胖症、肾病等疾病。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术要解决的技术问题是提供一种新型、全人源抗PCSK9抗体及其抗原结合片段。该抗体及其抗原结合片段可特异性结合PCSK9，有效抑制PCSK9对肝细胞表面LDLR的降解，从而提高肝细胞LDLR水平，增强肝细胞对LDL-C的吸收功能。本专利技术还要解决的技术问题是提供上述全人源抗PCSK9抗体及其抗原结合片段在制备预防和治疗包括但不局限于高胆固醇血症、高血脂症、动脉粥样硬化、心脑血管疾病、脂肪肝、肥胖症、肾病等疾病药物中的应用。技术方案：为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：构建人PCSK9重组表达质粒pTT5-hPCSK9，然后将该质粒瞬时转染CHO3E7细胞(南京金斯瑞生物科技有限公司)，悬浮培养7天后，离心收集培养液上清，采用镍柱亲和层析和分子排阻层析方法从中分离纯化得到重组人PCSK9蛋白。以人PCSK9蛋白为靶抗原从高容量全人源噬菌体抗体库中筛选出抗PCSK9单链抗体。结合KABAT数据库序列比对和突变热点分析设计简并寡核苷酸引物，采用全质粒PCR扩增方式分别在六个CDR区引入半随机突变。PCR扩增产物经DpnI酶切原模板后，电转化大肠杆菌E.coliTG1超级感受态细胞，制备全人源抗PCSK9单链抗体突变体库，经噬菌体展示筛选后，获得6个亲和力和活性均较高的优势突变体。采用CDR区交叉克隆方法(Molecularimmunology.2008；46:135-144)进一步提高优势突变体的亲和力和活性。在此基础上，将获得的高活性抗PCSK9单链抗体进行全长化，并检测其体外和体内生物学活性。本专利技术获得的抗体及其抗原结合片段可特异性结合PCSK9，有效抑制PCSK9与LDLR之间的相互作用，阻断PCSK9介导的LDLR降解，显著增强肝细胞对LDL-C的摄取能力。更具体地，本专利技术所述抗体或抗体片段包括重链可变区和轻链可变区，在一些实施例中，重链可变区和轻链可变区通过含15个氨基酸的柔性肽(GGGGSGGGGSGGGGS)连接形成单链抗体；在另外一些实施例中，重链可变区和轻链可变区通过与人IgG1恒定区连接形成全长抗体。所述重链的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别用HCDR1、HCDR2、HCDR3表示；所述轻链的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别用LCDR1、LCDR2、LCDR3表示。更具体而言，HCDR1包含SEQIDNO：1～6任一所示的氨基酸序列，或者包含与SEQIDNO：1～6所示的任一氨基酸序列具有至少85％同一性的序列，优选至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同一性的序列，或者与所述序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列；HCDR2包含SEQIDNO：7、8所示的任一氨基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种全人源抗PCSK9抗体或其抗原结合片段，其特征在于：包含重链可变区和轻链可变区，/n所述重链可变区包含互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3；所述轻链可变区包含互补决定区LCDR1、LCDR2、LCDR3；/n其中：/nHCDR1包含SEQ ID NO：1～6所示的任一氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：1～6所示的任一氨基酸序列具有至少85％同一性的序列；和/或/nHCDR2包含SEQ ID NO：7、8所示的任一氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：7、8所示的任一氨基酸序列具有至少85％同一性的序列；和/或/nHCDR3包含SEQ ID NO：9～12所示的任一氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：9～12所示的任一氨基酸序列具有至少85％同一性的序列；和/或/nLCDR1包含SEQ ID NO：13～15所示的任一氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：13～15所示的任一氨基酸序列具有至少85％同一性的序列；和/或/nLCDR2包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的序列；和/或/nLCDR3包含SEQ ID NO：17～24所示的任一氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：17～24所示的任一氨基酸序列具有至少85％同一性的序列。/n...

【技术特征摘要】
1.一种全人源抗PCSK9抗体或其抗原结合片段，其特征在于：包含重链可变区和轻链可变区，
所述重链可变区包含互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3；所述轻链可变区包含互补决定区LCDR1、LCDR2、LCDR3；
其中：
HCDR1包含SEQIDNO：1～6所示的任一氨基酸序列，或者包含与SEQIDNO：1～6所示的任一氨基酸序列具有至少85％同一性的序列；和/或
HCDR2包含SEQIDNO：7、8所示的任一氨基酸序列，或者包含与SEQIDNO：7、8所示的任一氨基酸序列具有至少85％同一性的序列；和/或
HCDR3包含SEQIDNO：9～12所示的任一氨基酸序列，或者包含与SEQIDNO：9～12所示的任一氨基酸序列具有至少85％同一性的序列；和/或
LCDR1包含SEQIDNO：13～15所示的任一氨基酸序列，或者包含与SEQIDNO：13～15所示的任一氨基酸序列具有至少85％同一性的序列；和/或
LCDR2包含SEQIDNO：16所示的氨基酸序列，或者包含与SEQIDNO：16所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的序列；和/或
LCDR3包含SEQIDNO：17～24所示的任一氨基酸序列，或者包含与SEQIDNO：17～24所示的任一氨基酸序列具有至少85％同一性的序列。


2.根据权利要求1所述的全人源抗PCSK9抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区的序列包含SEQIDNO：25～35所示的任一氨基酸序列，或者包含与SEQIDNO：25～35所示的任一氨基酸序列具有大于等于85％同一性的序列；和/或
所述轻链可变区序列包含SEQIDNO：36～46所示的任一氨基酸序列，或者包含与SEQIDNO：36～46所示的任一氨基酸序列具有大于等于85％同一性的序列。


3.根据权利要求2所述的全人源抗PCSK9抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包括以下任一种：
(a)含有SEQIDNO25所示的重链可变区和SEQIDNO36、38、39、41、42、43、44或45的任一所示的轻链可变区的抗体或抗原结合片段，或与其具有至少85％同一性的序列；
(b)含有SEQIDNO26所示的重链可变区和SEQIDNO37所示的轻链可变区的抗体或抗原结合片段，或与其具有至少85％同一性的序列；
(c)含有SEQIDNO27、28、29、30、32、33或34所示的重链可变区和SEQIDNO36所示的...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭树华，徐梦龙，汪可，陈满满，雷高新，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32