本发明专利技术涉及生物医学技术领域，尤其涉及EGFP‑Wnt2融合蛋白抗原和Wnt2单克隆抗体以及Wnt2单克隆抗体的应用，EGFP‑Wnt2融合蛋白抗原主要是EGFP与人源Wnt2除信号肽的全长氨基酸序列的融合蛋白，所述EGFP‑Wnt2融合蛋白抗原包括EGFP氨基酸序列、TEV酶切位点和FLAG标签序列、Wnt2除信号肽全长氨基酸序列、6×His标签序列，抗Wnt2单克隆抗体能够用于抑制肿瘤细胞的免疫逃逸和生长。本发明专利技术的Wnt2单克隆抗体结合细胞分泌的人Wnt2抗原时，拮抗细胞对肿瘤内抑制性免疫微环境形成的促进，抑制肿瘤细胞的免疫逃逸及生长。本发明专利技术提供的Wnt2单克隆抗体能够用于食管鳞癌、胃癌、胰腺癌、直肠结肠癌、肺癌、乳腺癌、胶质细胞瘤、肝癌等实体肿瘤的免疫治疗中。
【技术实现步骤摘要】
EGFP-Wnt2融合蛋白抗原和Wnt2单克隆抗体以及Wnt2单克隆抗体的应用
本专利技术涉及生物医学
，尤其涉及EGFP-Wnt2融合蛋白抗原和Wnt2单克隆抗体以及Wnt2单克隆抗体的应用。
技术介绍
实体肿瘤细胞的免疫逃逸是临床肿瘤免疫治疗和肿瘤免疫学基础研究的热点和难点之一。目前PD-1/PD-L1阻断抗体在实体肿瘤治疗的早期临床试验中展现了不错的潜力，然而免疫疗法往往会受制于实体肿瘤免疫微环境及其复杂的免疫逃逸调控，导致总响应率不高甚至耐药。深入探讨肿瘤免疫逃逸分子机制，寻找新的免疫治疗靶点，将为发展新型高效的肿瘤免疫疗法提供十分重要的指导意义。目前，生物医学研究者越来越重视肿瘤微环境对肿瘤进展及治疗的作用，其中，肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associatedfibroblasts,CAFs)居重要地位。目前认为CAFs对肿瘤的演进起着促进作用，CAFs在肿瘤发生、进展、转移等各个过程中都产生重要的影响，可以通过肿瘤和非肿瘤成分促进肿瘤的演化。研究发现：靶向FAP+CAFs分泌的CXCL12的治疗，可以促进T细胞的肿瘤浸润，从而有效增强PD-L1的免疫治疗效果，表明FAP+CAFs可以通过释放CXCL12调节免疫抑制的微环境(FeigCetal,PNAS.2013)。此外，CAFs释放的FAP蛋白可以通过STAT3-CCL2信号通路促进MDSC的肿瘤浸润，从而抑制抗肿瘤免疫反应(YangXetal,CancerRes.2016)。虽然CAFs目前已被证实可以调节肿瘤细胞的免疫逃逸，但由于肿瘤细胞发生免疫耐受的机制复杂，CAFs参与其中的分子调控网络仍有待进一步的发掘和阐明。从食管癌患者的癌组织和癌旁组织中分别成功分离出CAFs和其相应的正常纤维母细胞(NFs)，并应用基因芯片比较分析了CAF和NF的基因表达差异。结果显示，126个基因在功能方面分别与细胞增殖(61个基因)，细胞外间质重构(40个基因)以及免疫反应(25个基因)有关。以往研究发现，Wnt2基因在食管鳞癌CAFs的表达显著上调(ZhangCetal,ClinCancerRes.2009)，既往也有研究报道Wnt/β-catenin信号通路能够促进免疫逃逸,提示CAFs分泌的Wnt2蛋白可能参与实体肿瘤免疫抑制微环境的调控。此外，Wnt2也被报道在多种肿瘤组织中高表达，包括食管鳞癌(Fuetal,Gut.2010)胰腺癌(YuMetal,Nature.2012)、结直肠癌(KramerNetal，Oncogene.2017)、胃癌(KatohM,IntJOncol.2001)、肺癌(HuangCetal,AmJCancerRes.2015)、乳腺癌(DaleTCetal,CancerRes.1996)等。综上所述，深入了解分泌性Wnt2蛋白的免疫调控机理，对于研发靶向Wnt2高表达肿瘤的新型免疫疗法、制定肿瘤风险评估以及预后判断的有效措施具有重要的临床意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的是提供一种新的Wnt2单克隆抗体，该Wnt2单克隆抗体结合细胞分泌的人Wnt2抗原时，拮抗细胞对肿瘤内抑制性免疫微环境形成的促进，抑制肿瘤细胞的免疫逃逸及生长。本专利技术提供的Wnt2单克隆抗体能够用于食管鳞癌、胃癌、胰腺癌、直肠结肠癌、肺癌、乳腺癌、胶质细胞瘤、肝癌等实体肿瘤的免疫治疗中。本专利技术通过以下技术手段解决上述技术问题：在本专利技术的第一方面，提供了一种EGFP-Wnt2融合蛋白抗原，所述EGFP-Wnt2融合蛋白抗原主要是EGFP与人源Wnt2除信号肽的全长氨基酸序列的融合蛋白，所述EGFP-Wnt2融合蛋白抗原包括EGFP氨基酸序列、TEV酶切位点和FLAG标签序列、Wnt2除信号肽全长氨基酸序列、6×His标签序列。进一步，所述EGFP-Wnt2融合蛋白抗原的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。在本专利技术的第二方面，提供了一种核苷酸，所述核苷酸编码如上述第一方面所述的EGFP-Wnt2融合蛋白抗原，所述核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。在本专利技术的第三方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有如上述第二方面所述的核苷酸。在本专利技术的第四方面，提供了EGFP-Wnt2融合蛋白抗原的制备方法，包括如下步骤：S1.将EGFP基因与除去ER信号肽的人源野生型Wnt2基因融合，在两个基因之间插入TEV酶切位点和FLAG标签序列，并在氨基端加上大鼠生长激素的ER信号肽，进行分泌表达，在Wnt2的羧基末端接上6×His标签，产生的序列的前后端加上一对限制性内切酶BamHI和SexAI，用于构建到慢病毒表达载体pLV-Puro的CMV启动子下游，同时去除原有的Puro基因，获得质粒pCMV-EGFP-Wnt2；S2.将pCMV-EGFP-Wnt2与质粒pH1、pH2共转染至慢病毒包装系细胞293V，经5代或20天以上培养获得稳定表达目的蛋白细胞后，荧光显微镜下，用50μl的移液枪挑取不同表达水平的EGFP-Wnt2/293细胞克隆25-30个，分别扩增培养这些细胞克隆，收集上清，进行促细胞迁移作用的Wnt2蛋白功能验证，将有功能的克隆扩增培养，并收集上清液，经镍离子亲和层析凝胶柱纯化后，得到融合蛋白EGFP-Wnt2融合蛋白。在本专利技术的第五方面，提供了一种Wnt2单克隆抗体，所述Wnt2单克隆抗体是能够与上述第一方面所述的EGFP-Wnt2融合蛋白抗原以及用TEV酶或EK酶切除其EGFP后的Wnt2蛋白特异性结合的抗体，所述Wnt2单克隆抗体用于抑制肿瘤细胞的免疫逃逸和生长。本专利技术提供Wnt2基因及其编码蛋白具有诱导DC前体细胞表达IDO1蛋白，促进抑制性DC(IDO1+CD11c+)细胞发育分化，进而一方面降低DC细胞的免疫活性，另一方面促进Treg细胞的形成，并抑制CD8+T细胞的功能，而针对人Wnt2制备的Wnt2单克隆抗体则可以有效降低逆转这一过程的应用。进一步，所述Wnt2单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区包括氨基酸序列如下的三个互补决定区：H-CDR1：GYTFTDFD，H-CDR2：HPESDYT，和H-CDR3：TGDR；轻链可变区包括氨基酸序列如下的三个互补决定区：L-CDR1：KSVSTSGYSY，L-CDR2：LVS，L-CDR3：QHIRELTR。进一步，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO:4所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO:6所示。在本专利技术的第六方面，提供了一种分离的核苷酸分子，编码如上述第五方面所述的Wnt2单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示，编码如上述第五方面所述的Wnt2单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示。在本专利技术的第七方面，提供了一种含有上述第六方面描述的核苷酸分子的载体。在本专利技术的第八方面，提供了一种宿主细胞，该宿主细胞含有如上述第七方面所述本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.EGFP-Wnt2融合蛋白抗原，其特征在于，所述EGFP-Wnt2融合蛋白抗原主要是EGFP与人源Wnt2除信号肽的全长氨基酸序列的融合蛋白，所述EGFP-Wnt2融合蛋白抗原包括EGFP氨基酸序列、TEV-FLAG标签序列、Wnt2除信号肽全长氨基酸序列、6×His标签序列。/n
【技术特征摘要】
1.EGFP-Wnt2融合蛋白抗原，其特征在于，所述EGFP-Wnt2融合蛋白抗原主要是EGFP与人源Wnt2除信号肽的全长氨基酸序列的融合蛋白，所述EGFP-Wnt2融合蛋白抗原包括EGFP氨基酸序列、TEV-FLAG标签序列、Wnt2除信号肽全长氨基酸序列、6×His标签序列。
2.根据权利要求1所述的EGFP-Wnt2融合蛋白抗原，其特征在于，所述EGFP-Wnt2融合蛋白抗原的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。
3.核苷酸，其特征在于，所述核苷酸编码如权利要求2所述的EGFP-Wnt2融合蛋白抗原，所述核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
4.EGFP-Wnt2融合蛋白抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.将EGFP基因与除去ER信号肽的人源野生型Wnt2基因融合，在两个基因之间插入TEV酶切位点和FLAG标签序列，并在氨基端加上大鼠生长激素的ER信号肽，进行分泌表达，在Wnt2的羧基末端接上6×His标签，产生的序列的前后端加上一对限制性内切酶BamHI和SexAI，用于构建到慢病毒表达载体pLV-Puro的CMV启动子下游，同时去除原有的Puro基因，获得质粒pCMV-EGFP-Wnt2；
S2.将pCMV-EGFP-Wnt2与质粒pH1、pH2共转染至慢病毒包装系细胞293V，经5代或20天以上培养获得稳定表达的蛋白细胞后，荧光显微镜下，用50μl的移液枪挑取不同表达水平的EGFP-Wnt2/293细胞克隆25-30个，分别扩增培养这些细胞克隆，收集上清，进行促细胞迁移作用的Wnt2蛋白功能验证，将有功能的克隆扩增培养，并收集上清液，经镍离子亲和层析凝胶柱纯化后，得到EGFP-Wnt2融合蛋白。
5.Wnt2单克隆抗体，其特征在于，所述Wnt2单克隆抗体是能够与权...
【专利技术属性】
技术研发人员：付利，黄土雄，范春雷，武虎，陈喆，匡红，刘美星，
申请(专利权)人：杭州科兴生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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