一种基于PD-1/PDL-1阻断功能及生物效应的抗癌药物快速筛选方法技术

本发明专利技术建立了一种基于PD‑1/PDL‑1阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法：将红色荧光蛋白RFP接于PDL‑1蛋白C端，构建PDL‑1‑RFP融合蛋白；将抗CD3的抗体通过一个人工跨膜节段偶联于MHC II蛋白下游，构建MHCII‑antiCD3融合蛋白；将人源PD‑1基因构建在高表达启动子CMV的下游，后续连接T细胞核因子转录应答元件与TATA‑Like Promoter以及绿色荧光蛋白基因d2EGFP，构建慢病毒载体，并建立高表达PD1的CMV_PD1.NFAT_d2EGFP/Jurkat稳转细胞系，以PDL‑1‑RFP与细胞系的亲和进行荧光检测筛选阻断剂。本方法可精确反映抗PD‑1或抗PDL‑1药物的PD‑1/PDL‑1阻断功能以及通过对PD‑1/PDL‑1的阻断作用对NFAT信号通路产生的生物学效应，判断其是否可以提高T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。

A Rapid Screening Method for Anticancer Drugs Based on Blocking Function and Biological Effects of PD-1/PDL-1

The invention establishes a rapid drug screening method based on the blocking function and biological effects of PD_1/PDL_1: connecting red fluorescent protein RFP to the C end of PDL_1 protein to construct PDL_1_RFP fusion protein; coupling anti-CD3 antibodies downstream of MHC II protein through an artificial transmembrane segment to construct MHCII_antiCD3 fusion protein; and constructing human PD_1 gene to start high expression. A lentivirus vector was constructed by linking T cell nuclear factor transcription response elements with TATA Like Promoter and green fluorescent protein gene d2EGFP downstream of sub-CMV. A CMV_PD1.NFAT_d2EGFP/Jurkat stable cell line with high expression of PD1 was established to screen blockers by fluorescence detection of affinity between PDL 1 RFP and cell line. This method can accurately reflect the blocking function of PD_1/PDL_1 of anti-PD_1 or anti-PDL_1 drugs and the biological effects on NFAT signaling pathway by blocking the effect of PD_1/PDL_1 to determine whether it can improve the killing effect of T cells on cancer cells.

【技术实现步骤摘要】
一种基于PD-1/PDL-1阻断功能及生物效应的抗癌药物快速筛选方法
本专利技术涉及一种抗PD-1和抗PDL-1药物的快速筛选方法，属于生物

技术介绍
肿瘤通过其细胞表面表达的细胞程序性死亡配体1(Programmedcelldeath1ligand1，PDL-1)与CD8+T细胞表面表达的细胞程序性死亡受体1(Programmedcelldeathprotein1，PD-1)特异性结合，传导抑制性的信号，减低淋巴结CD8+T细胞的增生，从而使肿瘤细胞逃避免疫系统T细胞的杀伤作用。因而阻断PD-1/PDL-1的结合是肿瘤免疫治疗的重要方向之一。基于该靶点的PD-1/PDL-1阻断药物，如抗PD1、抗PDL-1单抗药、小分子、多肽阻断剂等成为目前抗癌药研发的热门。而基于PD-1/PDL-1阻断功能及生物效应的药物筛选方法是这类新药研发的核心技术之一。本专利技术中下列表达式的意义为：PD-1：Programmedcelldeathprotein1，程序性死亡受体1PDL-1：Programmedcel1death1ligand1，程序性死亡配体1MHC：Majorhistocompatibilitycomplex，主要组织相容性复合体CD3：Clusterofdifferentiation3，分化簇3NFAT：NuclearfactorofactivatedTcells，活化T细胞核因子Jurkat：人急性T淋巴细胞白血病细胞TCR：Tcellreceptor，T细胞抗原受体CMV：Cytomegalovirus，巨细胞病毒RFP：Redfluorescentprotein，红色荧光蛋白d2EGFP：Destabilizedenhancedgreenfluorescentprotein不稳定增强型绿色荧光蛋白
技术实现思路
本专利技术的目的是建立了一种新型的基于PD-1/PDL-1阻断功能及生物效应的抗癌药物快速筛选方法。本专利技术构思如下：将红色荧光蛋白RFP接于PDL-1蛋白C端，构建PDL-1-tagRFP融合蛋白；将抗CD3的抗体通过一个人工跨膜节段TLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAV偶联于MHCII蛋白下游，构建MHCII-antiCD3融合蛋白。将绿色荧光蛋白基因d2EGFP构建在T细胞核因子转录应答元件(NFAT)与TATA-LikePromoter的下游，将人源PD-1基因构建在高表达启动子CMV的下游，构建慢病毒载体pCMV_PD1.NFAT_d2EGFP。将pCMV_PD1.NFAT_d2EGFP与质粒pH1、pH2共转染至慢病毒包装系细胞293V，收集CMV_PD1.NFAT_d2EGFP慢病毒并转染Jurkat，筛选构建高表达PD1的CMV_PD1.NFAT_d2EGFP/Jurkat稳转细胞系。将抗PD-1或抗PDL-1的单抗药、小分子、或多肽阻断剂等新药与CMV_PD-1.NFAT_d2EGFP/Jurkat细胞共孵育后加入PDL-1-tagRFP融合蛋白和MHC-CD3抗体融合蛋白孵育；清洗去除非特异性结合后检测CMV_PD-1.NFAT_d2EGFP/Jurkat细胞表面的红色荧光蛋白RFP荧光值，判断抗PD1或抗PDL-1药的PD-1/PDL-1阻断功能；或者孵育后清洗去除非特异性结合后分析检测CMV_PD-1.NFAT_d2EGFP/Jurkat细胞内的绿色荧光蛋白d2EGFP荧光值；判断抗PD1或抗PDL-1药通过对PD-1/PDL-1的阻断作用对NFAT信号通路产生的生物学效应，是否可以提高T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种基于PD-1/PDL-1阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法，包括以下步骤：1)将红色荧光蛋白RFP接于PDL-1蛋白C端，构建PDL-1-tagRFP融合蛋白；2)将抗CD3的抗体通过一个人工跨膜节段TLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAV偶联于MHCII蛋白下游，构建MHCII-antiCD3融合蛋白；3)将绿色荧光蛋白基因d2EGFP构建在T细胞核因子转录应答元件(NFAT)与TATA-LikePromoter的下游，将人源PD-1基因构建在高表达启动子CMV的下游，构建慢病毒载体pCMV_PD1.NFAT_d2EGFP；4)将pCMV_PD1.NFAT_d2EGFP与质粒pH1、pH2共转染至慢病毒包装系细胞293V，收集CMV_PD1.NFAT_d2EGFP慢病毒并转染Jurkat，筛选构建高表达PD1的CMV_PD1.NFAT_d2EGFP/Jurkat稳转细胞系；5)将抗PD-1或抗PDL-1的单抗药、小分子、或多肽阻断剂等新药与CMV_PD-1.NFAT_d2EGFP/Jurkat细胞共孵育后加入PDL-1-tagRFP融合蛋白和MHC-CD3抗体融合蛋白孵育；清洗去除非特异性结合后检测CMV_PD-1.NFAT_d2EGFP/Jurkat细胞表面的红色荧光蛋白RFP荧光值，判断抗PD1或抗PDL-1药的PD-1/PDL-1阻断功能；或处理细胞后检测分析CMV_PD-1.NFAT_d2EGFP/Jurkat细胞内的绿色荧光蛋白d2EGFP荧光值，判断该抗PD1药通过对PD-1/PDL-1的阻断作用对NFAT信号通路产生的生物学效应，是否可以提高T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。进一步地，步骤1)中，将红色荧光蛋白tagRFP基因与人全长PDL一1基因构建在同一个读码框使红色荧光蛋白RFP接于PDL-1蛋白C端形成PDL-1-RFP融合蛋白，在RFP的C端接上6个组氨酸His标签。进一步地，步骤1)中，编码带有组氨酸His标签的PDL-1-tagRFP融合蛋白的序列前后两端具有限制性内切酶酶切位点EcoRI(GAATTC)和SexAI(ACCTGGT)。进一步地，步骤1)中，编码带有组氨酸His标签的PDL-1-RFP融合蛋白基因序列合成后，用前后两端的限制性内切酶EcoRI(GAATTC)和SexAI(ACCTGGT)于连接于慢病毒表达载体pLV-Puro的CMV启动子下游，获得质粒pCMV-PDL1tagRFP(图1)，去掉了原质粒中的PGK启动子和Puro抗性基因，有利于提高慢病毒的转染效率，而阳性克隆的筛选可利用目标蛋白中tagRFP荧光蛋白直接用分选型流式细胞仪筛选或荧光显微镜下挑取；编码PDL-1-tagRFP融合蛋白的DNA基因序列如SEQIDNO：1所示，表达后PDL-1-tagRFP融合蛋白序列如SEQIDNO：2所示。进一步地，步骤1)中，将pCMV-PDL1tagRFP与质粒ph1、pH2共转染至慢病毒包装系细胞293V，经5代或20天以上培养获得稳定表达目的蛋白细胞后，荧光显微镜下，用50μl的移液枪挑取高表达PDL-1-tagRFP融合蛋白的PDL-1-tagRFP/293细胞克隆；扩增收集PDL1tagRFP/293细胞，可用匀浆、超声、或冷冻高压细胞破碎仪裂解细胞，1500g高速离心后取沉淀加His结合缓冲液，上Ni2+或Co2+His亲和法柱制备纯化重组PDL-1-tagRFP融合蛋白。进一步地，步骤2)中，将一个人工跨膜节段TLVVGVVGGLL本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于PD‑1/PDL‑1阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法，包括以下步骤：1)将红色荧光蛋白RFP接于PDL‑1蛋白C端，构建PDL‑1‑RFP融合蛋白；2)将抗CD3的抗体通过一个人工跨膜节段TLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAV偶联于MHC II蛋白下游，构建MHCII‑antiCD3融合蛋白；3)将绿色荧光蛋白基因d2EGFP构建在T细胞核因子转录应答元件与TATA‑Like Promoter的下游，将人源PD‑1基因构建在高表达启动子CMV的下游，构建慢病毒载体pCMV_PD1.NFAT_d2EGFP；4)将pCMV_PD1.NFAT_d2EGFP与质粒pH1、pH2共转染至慢病毒包装系细胞293V，收集CMV_PD1.NFAT_d2EGFP慢病毒并转染Jurkat，筛选构建高表达PD1的CMV_PD1.NFAT_d2EGFP/Jurkat稳转细胞系；5)将抗PD‑1或抗PDL‑1的单抗药、小分子、或多肽阻断剂等新药与CMV_PD‑1.NFAT_d2EGFP/Jurkat细胞共孵育后加入PDL‑1‑RFP融合蛋白和MHC‑CD3抗体融合蛋白孵育；清洗去除非特异性结合后检测CMV_PD‑1.NFAT_d2EGFP/Jurkat细胞表面的红色荧光蛋白RFP荧光值，判断抗PD1或抗PDL‑1药的PD‑1/PDL‑1阻断功能；或处理细胞后检测分析CMV_PD‑1.NFAT_d2EGFP/Jurkat细胞内的绿色荧光蛋白d2EGFP荧光值，判断该抗PD1药通过对PD‑1/PDL‑1的阻断作用对NFAT信号通路产生的生物学效应，是否可以提高T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。...

【技术特征摘要】
1.一种基于PD-1/PDL-1阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法，包括以下步骤：1)将红色荧光蛋白RFP接于PDL-1蛋白C端，构建PDL-1-RFP融合蛋白；2)将抗CD3的抗体通过一个人工跨膜节段TLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAV偶联于MHCII蛋白下游，构建MHCII-antiCD3融合蛋白；3)将绿色荧光蛋白基因d2EGFP构建在T细胞核因子转录应答元件与TATA-LikePromoter的下游，将人源PD-1基因构建在高表达启动子CMV的下游，构建慢病毒载体pCMV_PD1.NFAT_d2EGFP；4)将pCMV_PD1.NFAT_d2EGFP与质粒pH1、pH2共转染至慢病毒包装系细胞293V，收集CMV_PD1.NFAT_d2EGFP慢病毒并转染Jurkat，筛选构建高表达PD1的CMV_PD1.NFAT_d2EGFP/Jurkat稳转细胞系；5)将抗PD-1或抗PDL-1的单抗药、小分子、或多肽阻断剂等新药与CMV_PD-1.NFAT_d2EGFP/Jurkat细胞共孵育后加入PDL-1-RFP融合蛋白和MHC-CD3抗体融合蛋白孵育；清洗去除非特异性结合后检测CMV_PD-1.NFAT_d2EGFP/Jurkat细胞表面的红色荧光蛋白RFP荧光值，判断抗PD1或抗PDL-1药的PD-1/PDL-1阻断功能；或处理细胞后检测分析CMV_PD-1.NFAT_d2EGFP/Jurkat细胞内的绿色荧光蛋白d2EGFP荧光值，判断该抗PD1药通过对PD-1/PDL-1的阻断作用对NFAT信号通路产生的生物学效应，是否可以提高T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。2.如权利要求1所述的药物快速筛选方法，其特征在于步骤1)中，将红色荧光蛋白RFP基因与人全长PDL-1基因构建在同一个读码框使红色荧光蛋白RFP接于PDL-1蛋白C端形成PDL-1-RFP融合蛋白，在RFP的C端接上6个组氨酸His标签；编码带有组氨酸His标签的PDL-1-RFP融合蛋白的序列前后两端具有限制性内切酶酶切位点EcoRI和SexAI。3.如权利要求2所述的药物快速筛选方法，其特征在于步骤1)中，编码带有组氨酸His标签的PDL-1-RFP融合蛋白序列插入慢病毒表达载体的CMV启动子下游，获得质粒pCMV-PDL1tagRFP；质粒pCMV-PDL1tagRFP上表达的靶标蛋白序列为PDL-1-tagRFP，编码PDL-1-tagRFP融合蛋白的DNA基因序列如SEQIDNO：1所示，表达后PDL-1-tagRFP融合蛋白序列如SEQIDNO：2所示。4.如权利要求3所述的药物快速筛选方法，其特征在于步骤1)中，将pCMV-PDL1tagRFP与质粒pH1、pH2共转染至慢病毒包装系细胞293V，经5代或20天以上培养获得稳定表达目的蛋白细胞后，荧光显微镜下，用50μl的移液枪挑取高表达PDL-1-tagRFP融合蛋白的PDL1tagRFP/293细胞克隆；扩增收集PDL1tagRFP/293细胞，可用匀浆、超声、或冷冻高压细胞破碎仪裂解细胞，1500g高速离心后取沉淀加His结合缓冲液，上Ni2+或Co2+His亲和法柱制备纯化重组PDL-1-tagRFP融合蛋白。5.如权利要求1-4之一所述的药物快速筛选方法，其特征在于步骤2)中，将一个人工跨膜节段TLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAV的基因接于MHCII基因下游，再接上CD3的抗体基因序列；将MHCII-...

【专利技术属性】
技术研发人员：范春雷，吴王亲，武虎，匡红，刘美星，莫一平，
申请(专利权)人：杭州科兴生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33