一种基于CD47/SIRPα阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法技术

本发明专利技术建立了一种基于CD47/SIRPα阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法：将红色荧光蛋白RFP偶联于CD47蛋白羧基未端(C端)；黄色荧光蛋白基因Ypet构建在SIRPα蛋白的下游，以及青色荧光蛋白基因CyPet通过一个连接肽(G4S)3构建在PTPN11基因的下游，分别构建真核表达载体，并获得新型的稳转细胞系SIRPαCyPet.SH2PTPN11Ypet/THP‑1，以CD47‑RFP与细胞系的亲和进行荧光检测筛选阻断剂。本方法可精确反映抗SIRPα和抗CD47药的效应，可同时获得阻断功能与CD47/SIRPα信号通路的生物学效应数据，构建快速筛选抗CD47/SIRPα药物和评估其生物学效应的实验模型。

【技术实现步骤摘要】
一种基于CD47/SIRPα阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法
本专利技术涉及一种基于CD47/SIRPα靶点的药物快速筛选方法，属于生物

技术介绍
CD47(ClusterofDifferentiαtion47，分化簇47)也被称为整合蛋白相关蛋白(IAP)，是一种跨膜蛋白。CD47属于免疫球蛋白超家族，可结合配体血小板反应蛋白-1(TSP-1)和信号调节蛋白α(SIRPα，SignalRegulatoryProteinα，信号调节蛋白α)。SIRPα是一个调节性膜糖蛋白，主要表达于髓细胞、干细胞或神经元。SIRPα的胞内域包含4个ITIMs(Immunoreceptortyrosine-basedinhibitorymotif，免疫受体基于酪氨酸的抑制域)，在SIRPα的胞外域结合CD47后传导信号至细胞内使ITIMs磷酸化，随即SHP磷酸酶，如PTPN11(PTPN11，SHP2：Tyrosine-proteinphosphatasenon-receptortype11，酪氨酸蛋白磷酸酶非受体11型)被招募到细胞膜上并磷酸化激活酪氨酸激酶SHP2；同时SHP磷酸酶会抑制细胞表面肌凝蛋白的积累，并导致吞噬作用的抑制。肿瘤细胞表面高表达CD47。CD47作为一种不吃我信号通过CD47/SIRPα信号系统使肿瘤细胞避免被免疫系统的巨噬细胞吞噬，因而CD47/SIRPα是某些癌症的潜在治疗靶点。基于CD47/SIRPα阻断功能的抗癌新药，包括抗CD47、抗SIRPα单抗药、小分子阻断剂、多肽阻断剂等的研发是目前医药领域热点之一。但目前为止尚未见有关基于CD47/SIRPα阻断功能及其生物效应的新药快速、高效而精准的筛选系统。
技术实现思路
本专利技术的目的是建立了一种基于CD47/SIRPα阻断功能及其生物学效应的药物快速筛选方法。本专利技术构思如下：采用红色荧光蛋白tagRFP偶联于CD47蛋白羧基末端；青色荧光蛋白基因CyPet构建在SIRPα蛋白的下游，黄色荧光蛋白基因Ypet通过一个连接肽(G4S)3构建在PTPN11蛋白N端2个SH2结构域基因的下游，将两个带有荧光蛋白标记基因的片段构建载体并在细胞内表达，建立稳转细胞系。将稳转细胞系诱导成巨噬细胞后与抗SIRPα或抗CD47的单抗药、小分子、或多肽阻断剂共同孵育，清洗非特异性结合后与加入CD47-tagRFP融合蛋白共孵育。通过检测红色荧光蛋白tagRFP荧光值判断该抗SIRPα或抗CD47药具有CD47/SIRPα阻断功能；通过检测CyPet/Ypet荧光值并与对照组比较，判断抗SIRPα或抗CD47药具有CD47/SIRPα阻断功能。为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种基于CD47/SIRPα阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法，包括以下步骤：1)将第一荧光蛋白与CD47蛋白羧基末端连接构建重组CD47-第一荧光蛋白融合蛋白；2)将第二荧光蛋白与构建在SIRPα蛋白的下游；将第三荧光蛋白基因构建在PTPN11蛋白N端2个SH2结构域基因的下游；在CMV启动子下分别连接SIRPα-第二荧光蛋白和SH2PTPN11-第三荧光蛋白基因片段，构建表达质粒；3)将CMV-SIRPα-第二荧光蛋白和CMV-SH2PTPN11-第三荧光蛋白基因共转染到单核细胞系中，建立稳转细胞系；4)稳转细胞系诱导成巨噬细胞后与抗SIRPα或抗CD47的单抗药、小分子、或多肽阻断剂等新药孵育，清洗非特异性结合后与重组CD47-第一荧光蛋白融合蛋白共孵育；5)分别检测第一、第二、第三荧光蛋白荧光值，并判断新药对CD47/SIRPα信号通路的阻断功能。进一步地，第一荧光蛋白是tagRFP红色荧光蛋白；第二荧光蛋白是青色荧光蛋白CyPet；第三荧光蛋白是黄色荧光蛋白Ypet。进一步地，步骤1)中，将tagRFP基因与人全长CD47基因构建在同一个读码框使tagRFP接于CD47蛋白C端形成所述CD47-tagRFP融合蛋白，同时在tagRFP的C端接上6个组氨酸His标签。进一步地，步骤1)中，将CD47-tagRFP基因通过EcoRI/SeXAI亚克隆到慢病毒表达载体pLV-puro的CMV启动子下，获得质粒pCMV-CD47tagRFP；；将pCMV-CD47tagRFP与慢病毒包装质粒pH1、pH2共转染到慢病毒包装系细胞293V，制备CMV-CD47tagRFP慢病毒，转染至人胚肾细胞293，筛选克隆获得高表达CD47-tagRFP融合蛋白的CD47tagRFP/293细胞系；扩增该CD47tagRFP/293细胞，裂解后用His亲和法制备纯化含重组CD47-RFP融合蛋白的膜碎片。进一步地，步骤2)中，将CyPet偶联于SIRPα的C端，YPet偶联于PTPN11(SHP2)的C端。进一步地，步骤2)中，将青色荧光蛋白CyPet基因构建在SIRPα蛋白基因的下游，通过EcoRI/SeXAI亚克隆到慢病毒表达载体pLV-puro的CMV启动子下，获得质粒pCMV-SIRPαCyPet；将黄色荧光蛋白基因Ypet通过一个连接肽(G4S)3构建在PTPN11蛋白N端2个SH2结构域基因的下游，即SH2PTPN1l[MCLVKGDRRFSDEFTLHEMESGREAGMMEKARGEVLKKKLWKGKFQRGGF]-(G4S)3-Ypet，并通过EcoRI/SeXAI亚克隆到慢病毒表达载体pLV-puro的CMV启动子下，获得质粒pCMV-SH2PTPN11Ypet；将pCMV-SIRPαCyPet和pCMV-SH2PTPN11Ypet分别与慢病毒包装质粒pH1、pH2共转染到慢病毒包装系细胞293V，制备CMV-SIRPαCyPet和CMV-SH2PTPN11Ypet慢病毒，共转染到人外周血的单核细胞THP-1中，建立SIRPαCyPet.SH2PTPN11Ypet/THP-1稳转细胞系。进一步地，步骤4)中，使用佛波酯诱导稳转细胞系成巨噬细胞。进一步地，步骤4)中，诱导成巨噬细胞后与抗SIRPα或抗CD47的单抗药、小分子、或多肽阻断剂等新药，并加入CD47-tagRFP融合蛋白共同孵育；同时设立SIRPαCyPet.SH2PTPN11Ypet/THP-1细胞与CD47-tagRFP融合蛋白直接共孵育的对照组。进一步地，步骤5)中，经缓冲液清洗去除非特异性结合后用流式细胞仪、或荧光酶标仪分析细胞表面的红色荧光蛋白RFP荧光值；按CyPet/Ypet荧光蛋白FRET法分析SIRPαCyPet.SH2PTPN11Ypet/THP-1细胞内的Ypet荧光值。通过药物组荧光值与对照组比较，判断抗SIRPα或抗CD47药对CD47/SIRPα阻断功能。另一方面，本专利技术提供一种稳转细胞系，其能够筛选对CD47/SIRPα信号通路具有阻断功能的药物。进一步地，该稳转细胞系中包含不同种类的荧光蛋白，分别与PTPN11基因和SIRPα基因连接，当CD47/SIRPα信号通路被阻断或正常连接时，能够激发不同的荧光信号。进一步地，该稳转细胞系中的荧光蛋白分别是光谱吸收峰/发射峰为Ex/Em＝435/477nm的青色荧光蛋白CyPet；光谱吸收峰/发射峰为Ex/Em＝本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于CD47/SIRP α阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法，包括以下步骤：1)将第一荧光蛋白与CD47蛋白羧基末端连接构建重组CD47‑第一荧光蛋白融合蛋白；2)将第二荧光蛋白与构建在SIRP α蛋白的下游；将第三荧光蛋白基因构建在PTPN11基因SH2结构域的下游；在CMV启动子下分别连接SIRP α‑第二荧光蛋白和SH2PTPN11‑第三荧光蛋白基因片段，构建表达质粒；3)将CMV‑SIRP α‑第二荧光蛋白和CMV‑8H2PTPN11‑第三荧光蛋白的基因共转染到单核细胞系中，建立稳转细胞系；4)稳转细胞系诱导成巨噬细胞后与抗SIRP α或抗CD47的单抗药、小分子、或多肽阻断剂等新药孵育，清洗非特异性结合后与重组CD47‑第一荧光蛋白融合蛋白共孵育；5)分别检测第一、第二、第三荧光蛋白荧光值，并判断新药对CD47/SIRP α信号通路的阻断功能。

【技术特征摘要】
1.一种基于CD47/SIRPα阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法，包括以下步骤：1)将第一荧光蛋白与CD47蛋白羧基末端连接构建重组CD47-第一荧光蛋白融合蛋白；2)将第二荧光蛋白与构建在SIRPα蛋白的下游；将第三荧光蛋白基因构建在PTPN11基因SH2结构域的下游；在CMV启动子下分别连接SIRPα-第二荧光蛋白和SH2PTPN11-第三荧光蛋白基因片段，构建表达质粒；3)将CMV-SIRPα-第二荧光蛋白和CMV-8H2PTPN11-第三荧光蛋白的基因共转染到单核细胞系中，建立稳转细胞系；4)稳转细胞系诱导成巨噬细胞后与抗SIRPα或抗CD47的单抗药、小分子、或多肽阻断剂等新药孵育，清洗非特异性结合后与重组CD47-第一荧光蛋白融合蛋白共孵育；5)分别检测第一、第二、第三荧光蛋白荧光值，并判断新药对CD47/SIRPα信号通路的阻断功能。2.根据权利要求1的药物快速筛选方法，其中第一荧光蛋白是RFP红色荧光蛋白；第二荧光蛋白是青色荧光蛋白基因CyPet；第三荧光蛋白是黄色荧光蛋白Ypet基因。3.根据权利要求2的药物快速筛选方法，其中步骤1)中，将红色荧光蛋白tagRFP基因与人全长CD47基因构建在同一个读码框使tagRFP接于CD47蛋白C端形成所述CD47-tagRFP融合蛋白，同时在tagRFP的C端接上6个组氨酸His标签。4.根据权利要求3的药物快速筛选方法，其中步骤1)中，将CD47-tagRFP基因通过EcoRI/SeXAI克隆到慢病毒表达载体pLV-puro的CMV启动子下，获得质粒pCMV-CD47tagRFP，去掉了原质粒中的PGK启动子和Puro抗性基因，有利于提高慢病毒的转染效率，而阳性克隆的筛选可利用目标蛋白中tagRFP荧光蛋白直接用分选型流式细胞仪筛选或荧光显微镜下挑取；将pCMV-CD47tagRFP与慢病毒包装质粒pH1、pH2共转染到慢病毒包装系细胞293V，制备CMV-CD47tagRFP慢病毒，转染至人胚肾细胞293，筛选克隆获得高表达CD47-tagRFP融合蛋白的CD47-tagRFP/293细胞系；扩增该CD47-tagRFP/293细胞，裂解后用His亲和法制备纯化含重组CD47-tagRFP融合蛋白的膜碎片。5.根据权利要求4的药物快速筛选方法，其中步骤2)中，将YPet偶联于PTPN11基因SH2结构域的C端，CyPet偶联于SIRPα的C端；将青色荧光蛋白CyPet基因构建在SIRPα蛋白的下游，构建SIRPα-CyPet融合蛋白基因，并通过EcoRI/SeXAI亚克隆到慢病毒表达载体pLV-puro的CMV启动子下，获得质粒pCMV-SIRPαCyPet；同样，将黄色荧光蛋白基因Ypet通过一个连接肽构建在PTPN11基因SH2结构域的下游，即SH2PTPN11-连接肽-Ypet，构建SH2PTPN11-Ypet融合蛋白基因，并通过EcoRI和SexAI亚克隆到慢病毒表达载体pLV-puro的CMV启动子下，获得质粒pCMV-SH2PTPN11Ypet；将pCMV-SIRPαCyPet和pCMV-SH2PTPN11Ypet分别与慢病毒包装质粒pH1、pH2共转染到慢病毒包装系细胞293V，制备CMV-SIRPαCyPet和CMV-SH2PTPN11Ypet慢病毒，并共转染到人外周血的单核细胞THP-1中，建立SIRPαCyPet.SH2PTPN11Ypet/THP-1稳转细胞系；其中编码CD47-tagRFP融合蛋白的核酸序列如SEQIDNO：1所示；CD47-tagRFP融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示；编码SIRPαCyPet融合蛋白的DNA基因序列如SEQIDNO：3所示，表达后SIRPαCyPet融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：4所示；编码SH2PTPN11Ypet融合蛋白的DNA基因序列如SEQIDNO：5...

【专利技术属性】
技术研发人员：范春雷，吴王亲，武虎，匡红，刘美星，莫一平，
申请(专利权)人：杭州科兴生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33