3D大脑类器官的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种3D大脑类器官的制备方法，包括：将RONA法获得的神经球经accutase消化为单细胞，计数后接种于细胞培养板上在培养基A中培养，培养至第7天后在培养基B中继续培养，培养至第25～35天时，Matrigel包裹神经球后继续培养至55～65天，第二次Matrigel包裹神经球后继续培养。本发明专利技术还提供了一种用于培养3D大脑类器官的培养基。本发明专利技术从RONA方法得到的高度纯化的神经球开始，用较为简单的方法可以控制并培养得到大小及结构均一的真正的3D大脑类器官，其具有大脑的六层皮层结构和抑制性中间神经细胞各亚型，适用于体外疾病研究、药物筛选等，具有重大的产业化的意义。

【技术实现步骤摘要】
3D大脑类器官的制备方法
本专利技术属于3D大脑类器官
，尤其涉及一种从人神经球制备3D大脑类器官的方法。
技术介绍
人的神经细胞或大脑组织很难获得，在体外几乎无法培养，使得很多神经疾病的研究和药物研发没有很好的人源模型而停滞不前。由胚胎干细胞或诱导多能干细胞诱导分化得到人的神经细胞作为神经疾病模型是这几年国际上的创新技术和热点。同时由于3D培养更能模拟大脑组织环境和细胞交流，对于神经细胞的成熟和功能有着重要的促进作用，并且所得到3D大脑类器官在研究人大脑发育和相关疾病上有不可替代的作用，最近各种人3D器官的体外培养成为新的热点。传统的人3D大脑类器官的制作方法一般通过从拟胚胎体(EmbryonicBody)开始，如2013年及2014年Lancaster等发表在Nature及Natureprotocol上的3D大脑类器官的制作方法使得界内在体外使用人多能干细胞(包括胚胎干细胞及诱导多能干细胞)得到3D的模拟人大脑的类器官上前进了一大步。最近Qian等2016年在Cell上发表的也是使用类似的方法从人多能干细胞制作大脑类器官来研究寨卡病毒引发小脑症的机制，并且专利技术了小的多孔板搅拌装置来降低因子的用量和成本，以及增加均一性。但是，这两种方法所得到的3D大脑类器官由于同时可能含有其他胚层的细胞和结构，难以稳定控制得到产品的可重复性，结构相似性等，在神经系统疾病模型和药物筛选领域的应用受到限制，同时也影响到用其所获得数据的代表性和可靠性。2017年Lee等在Neuropsychopharmacology上发表的文章中，其手工挑选出大小在50000～200000微米之间的玫瑰花样细胞簇(主要为NPC，神经前体细胞)，对其进行诱导，但是其得到的3D新大脑皮层小体不具有发育出后脑(NKX2.1染色为阴性)的潜能。而且，Lee等的方法较为复杂，无法做到简易，大批量而且均一。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种3D大脑类器官的制备方法，本专利技术提供的方法可以得到大小、结构均一的3D大脑类器官，且方法简易，适于产业化。本专利技术提供了一种3D大脑类器官的制备方法，包括：将RONA法获得的神经球经accutase消化为单细胞，计数后接种于细胞培养板上在培养基A中培养，培养至第7天后在培养基B中继续培养，培养至第25～35天时，包裹神经球后继续培养至55～65天，第二次包裹神经球后继续培养；所述培养基A包括：维甲酸、BDNF、GDNF、抗坏血酸、cAMP、Neurobasal培养基和不含维生素A的B27添加剂；所述培养基B包括：BDNF、GDNF、抗坏血酸、cAMP、Neurobasal培养基和不含维生素A的B27添加剂。本专利技术从RONA方法得到的高度纯化的神经球开始，保证了99％以上是神经干细胞，从而解决了其他方法含有非神经命运的干细胞及在后续培养中会出现非大脑组织的问题。本专利技术将神经球打散成为单细胞后计数并按固定数量接种，可以保证细胞团的大小和组成的均一性，即使培养至90天以后3D类脑器官的大小及结构也不会出现显著差异。同时本专利技术培养过程中使用的培养基A和培养基B确保所培养的3D大脑类器官能被诱导成为前脑，中脑和后脑三个脑区的组织，以及大脑六层皮层的细胞和结构。本专利技术从通过RONA法纯化得到的neurosphere(神经球)出发，该方法获得的人神经前体细胞99％以上是神经干细胞。RONA法纯化得到neurosphere(神经球)的具体过程参见XuJC和FanJ于2016年4月在ScienceTranslationalMedicine上所发表的Culturednetworksofexcitatoryprojectionneuronsandinhibitoryinterneuronsforstudyinghumancorticalneurotoxicity一文。本专利技术首先将通过RONA法纯化得到的neurosphere(神经球)经accutase消化为单细胞，计数后接种于细胞培养板上。具体而言，本专利技术计数后种植同等数量的1000～50000个细胞至多孔细胞培养板上，保证细胞团大小的均一。在一个实施例中，接种同等数量的1000～10000个细胞至圆底超低附的96孔细胞培养板的孔内。接种后在培养基A中进行培养，所述培养基A包括：维甲酸(retinoicacid)、BDNF、GDNF、抗坏血酸(ascorbicacid)、cAMP、Neurobasal培养基和不含维生素A的B27添加剂。在一个实施例中，所述培养基A包括：1～5μM维甲酸；10～30ng/mlBDNF；10～30ng/mlGDNF；0.1～0.5mM抗坏血酸；5～15μMcAMP；Neurobasal和不含维生素A的B27添加剂。在一个实施例中，所述培养基A包括：2μM维甲酸；20ng/mlBDNF；20ng/mlGDNF；0.2mM抗坏血酸；10μMcAMP；Neurobasal和不含维生素A的B27添加剂，其中，Neurobasal和不含维生素A的B27添加剂的用量比为50:1。接种后在培养基A中置于37℃，5％CO2细胞培养箱中的低速圆周摇床上摇动培养，每3～5天半量换液，第二天即可观察到每个孔内都形成一个大小均一的神经球，培养至第7天更换至培养基B中同等条件继续培养。在本专利技术中，所述培养基B包括：BDNF、GDNF、抗坏血酸、cAMP、Neurobasal培养基和不含维生素A的B27添加剂。在一个实施例中，所述培养基B包括：10～30ng/mlBDNF；10～30ng/mlGDNF；0.1～0.5mM抗坏血酸；5～15μMcAMP；Neurobasal和不含维生素A的B27添加剂。在一个实施例中，所述培养基B包括：20ng/mlBDNF；20ng/mlGDNF；0.2mM抗坏血酸；10μMcAMP；Neurobasal和不含维生素A的B27添加剂，其中，Neurobasal和不含维生素A的B27添加剂的用量比为50:1。在培养基B继续培养至第25～35天时，包裹神经球后继续培养至55～65天，第二次包裹神经球后继续培养，培养至85-100天左右，可以得到均一的模拟人大脑组成的3D大脑类器官，并可根据需求继续包裹和培养。具体而言，本专利技术在培养至第25～35天时，用Matrigel包裹神经球后继续培养至55～65天，用Matrigel第二次包裹神经球后继续培养。具体而言，本专利技术还可以在培养至第85～100天第三次包裹神经球后继续培养，第三次也用Matrigel包裹神经球。在一个实施例中，本专利技术培养至第30天时，包裹神经球后继续培养至60天，第二次包裹神经球后继续培养至90天第三次包裹神经球后继续培养。实验结果表明，本专利技术从RONA方法得到的高度纯化的神经球出发，制备的3D类脑小体的大小和形状都相对非常均一，而且在88天时直径可达到4mm并且仍然能继续生长；且其能够表达Nestin、Tuj1、Foxg1、TBR2、NKX2.1等标志物，具备发育出前脑、中脑和后脑的能力；其也能够表达BRN2，SATB2，CTIP2，TBR1等标志物，且在分布和比例上与大脑非常相似，具备稳定得到具有大脑皮层结构的能力。本专利技术从RONA方法得到的高度纯化的神经球开本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种3D大脑类器官的制备方法，其特征在于，包括：将RONA法获得的神经球经accutase消化为单细胞，计数后接种于细胞培养板上在培养基A中培养，培养至第7天后在培养基B中继续培养，培养至第25～35天时，包裹神经球后继续培养至55～65天，第二次包裹神经球后继续培养；所述第一培养基包括：维甲酸、BDNF、GDNF、抗坏血酸、cAMP、Neurobasal培养基和不含维生素A的B27添加剂；所述第二培养基包括：BDNF、GDNF、抗坏血酸、cAMP、Neurobasal培养基和不含维生素A的B27添加剂。

【技术特征摘要】
1.一种3D大脑类器官的制备方法，其特征在于，包括：将RONA法获得的神经球经accutase消化为单细胞，计数后接种于细胞培养板上在培养基A中培养，培养至第7天后在培养基B中继续培养，培养至第25～35天时，包裹神经球后继续培养至55～65天，第二次包裹神经球后继续培养；所述第一培养基包括：维甲酸、BDNF、GDNF、抗坏血酸、cAMP、Neurobasal培养基和不含维生素A的B27添加剂；所述第二培养基包括：BDNF、GDNF、抗坏血酸、cAMP、Neurobasal培养基和不含维生素A的B27添加剂。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将RONA法获得的神经球经accutase消化为单细胞，计数后接种同等数量的1000～50000个细胞至多孔细胞培养板上在培养基A中培养。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在培养基A中培养的条件为：在37℃，5％CO2细胞培养箱中的低速圆周摇床上摇动培养。4.根据权利要求1～3任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述培养基A包括：1～5μM维甲酸；10～30ng/mlBDNF；10～30ng/mlGDNF；0.1～0.5mM抗坏血酸；5～15μMcAMP；Neurobasal和不含维生素A的B27添加剂；所述培养基B包括：10～30ng/mlBDNF；10～30ng/mlGDNF；0.1～0.5mM抗坏血酸；5～15μMcAMP；Neurobasal和不含维生...

【专利技术属性】
技术研发人员：范靖，王安欣，徐金翀，邹潭，
申请(专利权)人：浙江霍德生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33