从胚胎干细胞或诱导多能干细胞产生神经前体细胞制造技术

本申请提供从胚胎干细胞(ESCs)或诱导多能干细胞(iPSCs)生成神经前体细胞(NPCs)特别是人神经前体细胞(hNPCs)的方法、细胞培养基及其组合，其中所述NPCs特别适合于临床前和临床应用。床应用。床应用。

【技术实现步骤摘要】
从胚胎干细胞或诱导多能干细胞产生神经前体细胞


[0001]本专利技术涉及从胚胎干细胞(ESCs)或诱导多能干细胞(iPSCs)产生神经前体细胞(NPCs)，特别是人神经前体细胞(hNPCs)的方法、细胞培养基及其组合，其中所述NPCs特别适合于临床前和临床用途。

技术介绍

[0002]神经前体细胞在细胞治疗中特别有价值，因为它们不仅可以自我更新并分化成所有类型的神经细胞，还可以迁移并整合到中枢神经系统的受损部分。同时，这些移植的NPCs可以分泌多种神经保护性和血管生成性细胞因子和微小RNA(microRNAs)来增强自主康复过程。因此，利用多能性的NPCs修复大脑和脊髓损伤的细胞替代疗法极具前景。
[0003]从2008年(Dimos等，2008)起，从人诱导多能干细胞(hiPSCs)或人胚胎干细胞(hESCs)体外诱导分化成人神经细胞的方法，及其在神经系统疾病、药物筛选、药物神经毒性测试、移植研究等各个方面的使用，已经成为科研和药物开发中的热点。通过先前已经存在的诱导神经分化的方法获得的神经干细胞或NPCs只能进一步分化成特定亚型的神经细胞，无论是在体外或是在体内，其通常难以具有相对成熟的功能，并且还存在诸如存活时间短和产量有限等问题。
[0004]在2016年，Xu等人(Xu等，Science Translational Medicine，2016)给出了一种新的神经分化方法，其能够从多能干细胞批量分化得到高纯度叉头框(forkhead box)G1阳性(FOXG1
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)的NPCs，分化得到的NPCs能够进一步分化成正确对应不同大脑皮层的各种细胞类型的神经细胞，包括各种兴奋性和抑制性神经元和星形胶质细胞，并在体外具有成熟的电生理功能和更长的生存期。然而，这篇文章中公布的方法使用了动物来源的试剂和成分不确定的组分。因此，非常需要开发一种稳定的方法，用于从多能干细胞产生质量稳定且适合于临床应用的NPCs。

技术实现思路

[0005]本专利技术的专利技术人们建立了一套能够从ESCs或iPSCs经由定向分化产生适合于临床和临床前应用的NPCs的方法学，由此满足了上述需求并完成了本专利技术。
[0006]因此，第一方面，本申请涉及一种从ESCs或iPSCs产生NPCs的方法，包括：
[0007](1)在人多能干细胞培养基(hPSC培养基)中培养ESCs或iPSCs以形成拟胚体(embryoid bodies，EBs)；
[0008](2)在包含基础培养基和添加剂的EB培养基中培养通过步骤(1)形成的EBs；
[0009](3)使用神经诱导培养基(NIM)在用胞外基质(ECM)包被的培养表面上培养步骤(2)之后的EBs以形成玫瑰花环样神经聚集体(ROsette Neural Aggregates，RONAs)，其中所述NIM包含基础培养基和添加剂；
[0010](4)培养通过步骤(3)形成的RONAs以形成神经球；和
[0011](5)将神经球分散成单个细胞并在使用NPC培养基在用ECM包被的培养表面上培养
以形成单层NPCs，
[0012]其中所述hPSC培养基，以及所述EB培养基、NIM、NPC培养基中包含的各种基础培养基和添加剂为临床级。
[0013]在进一步的实施方案中，所述EB培养基、NIM、NPC培养基中包含的各种基础培养基和添加剂中的一种或多种，优选全部，为GMP级、cGMP级或CTS
TM
级。更优选地，所述hPSC培养基、EB培养基、NIM和NPC培养基中的一种或多种，更优选两种、三种或四种，为临床级，优选GMP级、cGMP级或CTS
TM
级。
[0014]在具体的实施方案中，所述培养表面是培养板或培养瓶。
[0015]在一个实施方案中，所述hPSC培养基为临床级，优选GMP级、cGMP级或CTS
TM
级。具体来说，所述hPSC培养基选自以下几种：hPSC XF培养基、CTS
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Essential 8培养基、Basic03培养基、StemMACS
TM
iPS
‑
Brew培养基、ACF培养基、TeSR
TM
‑
AOF培养基和TeSR2培养基。在优选的实施方案中，所述hPSC培养基是hPSC XF培养基。
[0016]在一个实施方案中，所述hPSC培养基添加有ROCK抑制剂。在优选的实施方案中，所述ROCK抑制剂为临床级，优选GMP级、cGMP级或CTS
TM
级。
[0017]在一个实施方案中，所述EB培养基包含：
[0018](i)基础培养基，其选自a)至c)：
[0019]a)单独的KnockOut
TM
DMEM/F12培养基，
[0020]b)DMEM/F12培养基和Neurobasal
TM
培养基的组合，
[0021]c)KnockOut
TM
DMEM/F12培养基和Neurobasal
TM
培养基的组合；
[0022](ii)添加剂，其包含d)或e)，或由d)或e)组成：
[0023]d)N
‑
2添加剂和GlutaMAX
TM
‑
I添加剂；
[0024]e)N
‑
2添加剂、GlutaMAX
TM
‑
I添加剂和不含维生素A的B
‑
27
TM
添加剂(B
‑
27
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Supplement,minus vitamin A)；和
[0025](iii)任选的抑制剂。
[0026]在进一步的实施方案中，所述EB培养基包含：
[0027](i)基础培养基，其选自a)至c)：
[0028]a)单独的CTS
TM
KnockOut
TM
DMEM/F12培养基，
[0029]b)cGMP级DMEM/F12培养基与CTS
TM
Neurobasal
TM
培养基的组合，
[0030]c)CTS
TM
KnockOut
TM
DMEM/F12培养基和CTS
TM
Neurobasal
TM
培养基的组合；
[0031](ii)添加剂，其包含d)或e)，或由d)或e)组成：
[0032]d)CTS
TM
N
‑
2添加剂和CTS
TM
GlutaMAX
TM
‑
I添加剂；和
[0033]e)CTS
TM
N
‑
2添加剂、CTS
TM
GlutaMAX
TM
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种从胚胎干细胞(ESCs)或诱导多能干细胞(iPSCs)生成神经前体细胞(NPCs)的方法，包括：(1)在人多能干细胞培养基(hPSC培养基)中培养ESCs或iPSCs以形成拟胚体(EBs)；(2)在包含基础培养基和添加剂的EB培养基中培养通过步骤(1)形成的EBs；(3)使用神经诱导培养基(NIM)在用胞外基质(ECM)包被的培养表面上培养步骤(2)之后的EBs以形成玫瑰花环样神经聚集体(ROsette NeuralAggregates，RONAs)，其中所述NIM包含基础培养基和添加剂；(4)培养通过步骤(3)形成的RONAs以形成神经球；和(5)将神经球分散成单个细胞并使用NPC培养基在用ECM包被的培养表面上培养以形成单层NPCs，所述NPC培养基包含基础培养基和添加剂；其中所述hPSC培养基，以及所述EB培养基、NIM和NPC培养基中包含的基础培养基和添加剂为临床级。2.权利要求1的方法，其中所述EB培养基、NIM和NPC培养基中包含的基础培养基和添加剂中的一种或多种，优选全部，为GMP级、cGMP级或CTS
TM
级。3.权利要求1的方法，其中所述hPSC培养基、EB培养基、NIM和NPC培养基中的一种或多种，优选全部，为临床级，优选GMP级、cGMP级或CTS
TM
级。4.权利要求1的方法，其中所述hPSC培养基为hPSC XF培养基、CTS
TM
Essential 8培养基、Basic03培养基、StemMACS
TM
iPS
‑
Brew培养基、Stem
‑
ACF培养基、TeSR
TM
‑
AOF培养基或TeSR2培养基。5.权利要求1的方法，其中所述hPSC培养基添加有ROCK抑制剂。6.权利要求1的方法，其中所述EB培养基包含：(i)基础培养基，其选自a)至c)：a)单独的KnockOut
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DMEM/F12培养基，b)DMEM/F12培养基和Neurobasal
TM
培养基的组合，c)KnockOut
TM
DMEM/F12培养基和Neurobasal
TM
培养基的组合；和(ii)添加剂，其包含d)或e)，或由d)或e)组成：d)N
‑
2添加剂和GlutaMAX
TM
‑
I添加剂；e)N
‑
2添加剂、GlutaMAX
TM
‑
I添加剂和不含维生素A的B
‑
27
TM
添加剂(B
‑
27
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Supplement,minus vitamin A)。7.权利要求6的方法，其中所述EB培养基进一步包含抑制剂，所述抑制剂包含BMP抑制剂、AMPK抑制剂和ALK抑制剂，或由BMP抑制剂、AMPK抑制剂和ALK抑制剂组成；优选包含Noggin、SB431542、LDN
‑
193189、DMH
‑
1和Dorsomorphin中的一种或多种，或由Noggin、SB431542、LDN
‑
193189、DMH
‑
1和Dorsomorphin中的一种或多种组成；更优选包含SB431542与Noggin、LDN
‑
193189、DMH
‑
1和Dorsomorphin中的任何一种或多种的组合，例如Noggin、LDN
‑
193189、DMH
‑
1和Dorsomorphin一种或两种的组合，或由其组成。8.权利要求5或7的方法，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：范靖，王安欣，任芳，刘倩芸，邹潭，
申请(专利权)人：浙江霍德生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：