提供了使用BMP信号传导和MAPK/ERK信号传导的抑制剂将人多能干细胞分化为背神经外胚层祖细胞以及进一步分化为神经胶质祖细胞和少突胶质祖细胞(OPC)的方法。还提供了通过此类方法获得的细胞和细胞组合物，以及此类细胞的用途。进一步提供了在不存在腹侧形态发生素SHH或SHH信号传导活化剂的情况下将人多能干细胞有效分化为OPC的方法和方案。本公开内容的方法在分化过程的第7天可再现地产生背神经外胚层祖细胞，在分化过程的第21天可再现地产生神经胶质祖细胞，和在分化过程的第42天可再现地产生OPC。现地产生OPC。现地产生OPC。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】来自人多能干细胞的背源性少突胶质祖细胞
[0001]相关申请
[0002]本申请要求于2019年1月23日提交的美国临时申请62/796,077的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
[0003]本公开内容涉及将多能干细胞例如人胚胎干细胞首先分化为具有背脊髓祖细胞表型的神经外胚层祖细胞，然后进一步分化为神经胶质祖细胞，并且进一步分化为少突胶质祖细胞的新方法。还提供了通过此类方法获得的细胞和细胞组合物，以及此类细胞的用途。本公开内容进一步涉及通过根据本专利技术的方法产生的表达一种或多种标志物的细胞。
技术介绍
[0004]少突胶质祖细胞(OPC)是中枢神经系统(CNS)中神经胶质细胞的亚型，其出现在大脑和脊髓的脑室区中，并在成熟为少突胶质细胞之前迁移到整个发育中的CNS。成熟的少突胶质细胞产生髓鞘，其使神经元轴突绝缘并使其中已丢失髓鞘的CNS病变再形成髓鞘。少突胶质细胞还通过其他机制促成神经保护，包括产生促进神经元存活的神经营养因子(Wilkins等人,2001 Glia 36(1):48
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57；Dai等人,2003 J Neurosci.23(13):5846
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53；Du和Dreyfus,2002 J Neurosci Res.68(6):647
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54)。与大多数祖细胞不同，OPC在成人CNS中保持丰富，在那里它们保留产生新的少突胶质细胞的能力。因此，OPC和来源于OPC的成熟少突胶质细胞是脱髓鞘和髓鞘形成障碍病症(例如多发性硬化症、肾上腺脑白质营养不良和肾上腺脊髓神经病)、其他神经退行性病症(例如阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化和亨廷顿病)和急性神经系统损伤(例如中风和脊髓损伤(SCI))的重要治疗靶点。
[0005]已经开发了几种方案用于将人多能干细胞例如胚胎干细胞(ESC)和诱导多能干细胞(iPSC)分化成可用于细胞治疗的OPC。迄今为止，从人多能干细胞生成少突胶质祖细胞的方案已经概括了发育中的脊髓的腹侧运动神经元祖细胞(pMN)域，其已知在体内产生大多数脊髓OPC(Rowitch,2004 Nat Rev Neurosci.5(5):409
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19；Ravanelli和Appel,2015 Genes Dev.29(23):2504
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15)。产生腹源性OPC的腹侧神经祖细胞的诱导需要活化sonic hedgehog(SHH)信号传导。(Ericson等人,1996Cell 87:661
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673；Orentas等人,1999Development 126(11):2419
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29)。因此，现有的用于从多能干细胞产生OPC的体外方案依赖于胚状体形成作为刺激内源性SHH活化的手段(Nistor等人,2005 Glia49(3):385
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96)或SHH的直接添加或SHH信号传导的活化剂(Stacpoole等人,2013 Stem Cell Reports 1(5):437
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50；Douvaras和Fossati,2015Nat Protoc.10(8):1143
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54；Piao等人,2015 Cell Stem Cell16(2):198
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210；Wang等人,2013 Cell Stem Cell 12(2):252
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64；Rodrigues等人,2017 Stem Cell Reports 8(6):1770
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1783；和Yamashita等人,2017 PLoS One 12(2):e0171947)。前一种方法可能有问题，因为它依赖于胚状体内的自发分化，并且可能在分化过程结束时导致不需要的细胞类型(Priest等人,2015 Regen Med.10(8):939
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58；Manley等人,2017 Stem Cells Transl Med.6(10):1917
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1929)。后者的定向分化代表了目前用于
Med.10(8):939
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58；Manley等人,2017 Stem Cells Transl Med.6(10):1917
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1929)，除了根据本公开内容产生的OPC表达较低水平的非OPC标志物，包括与体外上皮包囊形成相关的标志物。
[0013]在一个优选的实施方案中，根据本专利技术的方法产生的OPC表达一种或多种选自神经/神经胶质抗原2(NG2)、血小板衍生生长因子受体A(PDGFRα)和神经节苷脂GD3(GD3)的标志物。在进一步优选的实施方案中，细胞的特征可以在于单一标志物或标志物的组合的表达。例如，根据本专利技术的方法产生的OPC的特征可以在于单独的NG2、PDGFRα或GD3，或具有标志物NG2、PDGFRα和GD3中的两个或三个的标志物组合。在一个优选的实施方案中，根据本专利技术的方法产生的细胞的至少90％表达NG2和/或PDGFRα。在进一步优选的实施方案中，至少50％的细胞进一步表达GD3。
[0014]在进一步优选的实施方案中，产生细胞的过程包括将细胞冷冻保存到中间库中然后解冻细胞以继续分化过程直至获得最终产品的一个或多个步骤。例如，中间细胞库可以在该过程的第14天、第28天和/或第35天进行冷冻保存。
[0015]在另一个实施方案中，根据本专利技术产生的OPC被制备为用于治疗患者的即用型(RTA)OPC细胞治疗组合物。还提出了配制用于在解冻后直接施用至受试者的人OPC和配制用于冷冻保存并在解冻后将冷冻保存的组合物施用至受试者的OPC细胞治疗组合物的方法。在另一方面，RTA组合物可配制成解冻和注射(TAI)组合物，由此组合物在解冻后通过注射施用，而无需OPC的进一步加工。
[0016]在一个实施方案中，本公开内容提供了一种用于从未分化的人多能干细胞获得包含背神经祖细胞(dNPC)的细胞群的方法。在某些实施方案中，该方法包括：a)获得未分化的人多能干细胞的培养物；b)在丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(MAPK/ERK)的至少一种抑制剂、骨形态发生蛋白(BMP)信号传导的至少一种抑制剂和视黄酸的存在下将所述未分化的人多能干细胞贴壁培养第一时间段，从而诱导分化为神经外胚层；和c)在存在视黄酸且不存在sonic hedgehog(SHH)或SHH信号传导活化剂的情况下，将来自b)的细胞贴壁培养第二时间段，从而获得背神经祖细胞。
[0017]在某些实施方案中，第一时间段是约3至4天。在某些实施方案中，第二时间段是约3至4天。
[0018]在某些实施方案中，该方法还包括附加步骤：收获来自c)的细胞，将所收获的细胞重新铺板在基底上并在碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)的存在下将细胞贴壁培养另外的一段时间，从而扩增细胞。在某些实施方案中，基底是细胞粘附肽。在其他实施方案中，基底是细胞外基质蛋白。在某些实施方案中，基本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于从未分化的人多能干细胞获得包含背神经祖细胞(dNPC)的细胞群的方法，所述方法包括：a)获得未分化的人多能干细胞的培养物；b)在丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(MAPK/ERK)的至少一种抑制剂、骨形态发生蛋白(BMP)信号传导的至少一种抑制剂和视黄酸的存在下将所述未分化的人多能干细胞贴壁培养第一时间段，从而诱导分化为神经外胚层；和c)在存在视黄酸且不存在sonic hedgehog(SHH)或SHH信号传导活化剂的情况下，将来自b)的细胞贴壁培养第二时间段，从而获得背神经祖细胞。2.权利要求1的方法，其还包括附加步骤：收获来自c)的细胞，将所收获的细胞重新铺板在基底上并在碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)的存在下将细胞贴壁培养另外的一段时间，从而扩增神经祖细胞。3.权利要求2的方法，其还包括附加步骤：收获扩增的细胞并将它们作为悬浮液中的聚集体在bFGF和EGF的存在下培养另外的一段时间，直到细胞成熟为神经胶质祖细胞。4.权利要求3的方法，其还包括附加步骤：将包含神经胶质祖细胞的聚集体铺板在基底上并在表皮生长因子(EGF)的存在下将细胞贴壁培养另外的一段时间，任选不时地分开细胞，直到细胞成熟为少突胶质祖细胞(OPC)。5.权利要求3的方法，其还包括附加步骤：将包含神经胶质祖细胞的聚集体铺板在基底上并在血小板衍生生长因子AA(PDGF
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AA)和EGF的存在下将细胞贴壁培养另外的一段时间，任选不时地分开细胞，直到细胞成熟为少突胶质祖细胞(OPC)。6.权利要求3的方法，其中所述细胞在所述方法的一个阶段被冷冻保存，随后解冻所述细胞并继续所述方法。7.权利要求1的方法，其中所述基底是重组人层粘连蛋白
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521。8.权利要求1的方法，其中所述人多能干细胞是人胚胎干细胞(hESC)。9.权利要求1的方法，其中所述人多能干细胞是人诱导多能干细胞(hiPSC)。10.权利要求1的方法，其中所述MAPK/ERK激酶的至少一种抑制剂选自PD0325901、AZD6244、GSK1120212、PD184352和考比替尼。11.权利要求1的方法，其中所述MAPK/ERK激酶的至少一种抑制剂是PD0325901。12.权利要求1的方法，其中所述BMP信号传导的至少一种抑制剂是活化素受体样激酶2(ALK2)的抑制剂。13.权利要求1的方法，其中所述BMP信号传导的至少一种抑制剂选自Dorsomorphin、DMH
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1、K022...
【专利技术属性】
技术研发人员：K，
申请(专利权)人：阿斯特里亚斯生物疗法股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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