环介导等温扩增结合侧向流动试纸条检测草鱼呼肠孤病毒制造技术

本发明专利技术公开了一种环介导等温扩增结合侧向流动试纸条法检测草鱼呼肠孤病毒。本发明专利技术提供了环介导等温扩增成套引物，由上游外引物、下游外引物、上游内引物和下游内引物组成；所述上游外引物的核苷酸序列为序列1；所述下游外引物的核苷酸序列为序列2；所述上游内引物的核苷酸序列为序列3；所述下游内引物的核苷酸序列为序列4。本发明专利技术具有比现有传统PCR技术检测GCRV的方法更高的特异性、灵敏度、实用性及便捷性，可以在实际现场即时检测，有利于预防控制草鱼呼肠孤病毒的爆发，对保护我国水产养殖经济发展具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
环介导等温扩增结合侧向流动试纸条检测草鱼呼肠孤病毒
本专利技术涉及病毒检测
，具体涉及一种环介导等温扩增结合侧向流动试纸条检测草鱼呼肠孤病毒。
技术介绍
草鱼是我国的“四大家鱼”之一，其养殖量占我国淡水养殖总产量的20％左右，为我国农业经济的重要组成部分。但是，草鱼在养殖过程中极易患病，其年成活率仅为30％左右，给我国草鱼养殖行业带来巨大的经济损失。在草鱼的常见病毒病当中，草鱼病毒性出血病被认为是对草鱼养殖危害最大的传染病。草鱼呼肠孤病毒(Grasscarpreovirus，GCRV)是草鱼出血病的主要病原，它具有高度的致死性和传染性。多年来，草鱼出血病频频暴发，导致草鱼大批量死亡，严重阻碍了我国草鱼养殖业的健康发展。GCRV是由我国首次分离鉴定的鱼类病毒，属于水生呼肠孤病毒属(Aquareovirus，AQRV)的C群，现在已有资料证明其致病力为水生呼肠孤病毒属中最强的毒株。近年来，随着分子生物学和细胞生物学的迅猛发展，在该病毒形态结构、对宿主敏感性以及其基因组学研究方面取得了众多研究成果，为GCRV的进一步深入研究以及防治草鱼出血病提供了重要理论依据。同时，对其检测方法的研究，如电镜观察、血清中和实验、PCR等技术也有报道，但对其快速可视化检测研究较少。环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)技术是Notomi等于2000年报道的一种新型核酸扩增方法(国际专利公开号：WO00/28082)，针对靶基因的6个位点设计4条LAMP引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(BstDNA聚合酶)，在恒温条件下快速、高效、高特异、高灵敏地扩增靶序列，适合于现场和实验条件较简单的实验室进行快速检测。引入一对环状引物的改进方法，进一步缩短了反应时间。侧向流动试纸条(Lateralflowdipstick，LFD)是一种新的检测方法，反应中FITC标记的探针与生物素标记的LAMP扩增产物特异性杂交，避免了琼脂糖凝胶电泳检测需使用实验仪器或荧光染料染色导致的由非特异性扩增造成的假阳性，进一步提高了反应的特异性和灵敏度。LFD检测无需特殊的设备，并且不需有毒试剂，操作者只需将产物和试纸条浸入缓冲液，操作简便且更安全。LAMP-LFD技术的检测结果可以直接肉眼观察。LFD试纸条上具有质控线和检测线，两条线均显色表示检测结果为阳性，只有质控线显色检测线不显色表明检测结果为阴性。LAMP-LFD结合方法安全、快捷、高效、高灵敏度，且无设备及技术限制，具有其他检测技术所无法替代的优势。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种环介导等温扩增结合侧向流动试纸条检测草鱼呼肠孤病毒。本专利技术提供的一种检测草鱼呼肠孤病毒的环介导等温扩增成套引物，由上游外引物、下游外引物、上游内引物和下游内引物组成；所述上游外引物为如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述下游外引物为如下(b1)或(b2)；(b1)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(b2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；所述上游内引物为如下(c1)或(c2)；(c1)序列表的序列3所示的单链DNA分子；(c2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；所述下游内引物为如下(d1)或(d2)；(d1)序列表的序列4所示的单链DNA分子；(d2)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子。上述成套引物中，所述上游内引物或所述下游内引物的末端采用生物素标记。上述成套引物中，所述上游内引物的末端采用生物素标记。上述成套引物中，所述上游内引物的5'末端采用生物素标记。上述成套引物中，所述上游外引物、所述下游外引物、所述上游内引物和所述下游内引物的摩尔比为1:1:8:8。本专利技术第2个目的是提供一种检测草鱼呼肠孤病毒的试剂，由上述的成套引物和探针组成；所述探针为如下(e1)或(e2)；(e1)序列表的序列5所示的单链DNA分子；(e2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子。所述探针的末端采用异硫氰酸荧光素FITC标记。所述探针的5'末端采用异硫氰酸荧光素FITC标记。本专利技术第3个目的是提供一种检测草鱼呼肠孤病毒的试剂盒，包括上述的成套引物或上述的试剂。上述的成套引物或上述的试剂或上述的试剂盒在检测或辅助检测草鱼呼肠孤病毒中的应用也是本专利技术保护的范围。上述的成套引物或上述的试剂或上述的试剂盒在制备检测或辅助检测草鱼呼肠孤病毒产品中的应用也是本专利技术保护的范围。上述的成套引物或上述的试剂或上述的试剂盒在检测或辅助检测待测样本是否感染草鱼呼肠孤病毒中的应用也是本专利技术保护的范围。上述的成套引物或上述的试剂或上述的试剂盒在制备检测或辅助检测待测样本是否感染草鱼呼肠孤病毒产品中的应用也是本专利技术保护的范围。本专利技术第4个目的是提供一种检测或辅助检测待测样本是否感染草鱼呼肠孤病毒的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤：1)提取待测样本的总RNA，反转录为cDNA；以所述cDNA为模板，采用上述的成套引物进行环介导等温扩增，得到环介导等温扩增产物；2)用上述的试剂中的所述探针杂交所述环介导等温扩增产物，得到杂交产物；3)采用侧向流动试纸条检测所述杂交产物，若所述试剂条的质控线和检测线均显色，则所述待测样本感染或候选感染草鱼呼肠孤病毒，若所述试剂条质控线显色且检测线未显色，则所述待测样本未感染或候选未感染草鱼呼肠孤病毒。所述方法中，所述杂交的条件63℃杂交5min。所述方法中，所述杂交的反应体系具体为：向步骤1)的扩增产物中加入所述探针(使其在反应体系中的浓度为0.8mmol/L)。所述方法中，所述步骤3)中的检测方法具体可为：取5μL杂交反应产物加入到100μLBuffer溶液(LFD试纸条试剂盒自带)，并将LFD试纸条(MileniaBiotecGmbH公司，货号：MGDH2)垂直浸入其中，静置5min，观察试纸条检测线是否显色。本专利技术第5个目的是提供一种检测或辅助检测待测样本是否感染草鱼呼肠孤病毒的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤：1)提取待测样本的总RNA，反转录为cDNA；以所述cDNA为模板，采用上述的成套引物进行环介导等温扩增，得到环介导等温扩增产物；2)电泳检测所述环介导等温扩增产物，若含有扩增产物，则所述待测样本感染或候选感染草鱼呼肠孤病毒，若不含有所述扩增产物，则所述待测样本未感染或候选未感染草鱼呼肠孤病毒。以上任一所述方法中，所述环介导等温扩增的条件为63℃水浴40min。以上任一所述方法中，所述环介导等温扩增的反应体系具体为：10×缓冲液2.5μL、MgSO41.5μL、上游外引物/下游外引物1μL、上游内引物/下游内引物1μL、dNTPs3.5μL、BstDNA聚合酶1μL、模板1μL，无菌水13.5μL，总体积25μL。缓冲液中各组分及其在所述反应体系中的浓度为：20mmol/LTris-HC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测草鱼呼肠孤病毒的环介导等温扩增成套引物，由上游外引物、下游外引物、上游内引物和下游内引物组成；所述上游外引物为如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述下游外引物为如下(b1)或(b2)；(b1)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(b2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；所述上游内引物为如下(c1)或(c2)；(c1)序列表的序列3所示的单链DNA分子；(c2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；所述下游内引物为如下(d1)或(d2)；(d1)序列表的序列4所示的单链DNA分子；(d2)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子。

【技术特征摘要】
1.一种检测草鱼呼肠孤病毒的环介导等温扩增成套引物，由上游外引物、下游外引物、上游内引物和下游内引物组成；所述上游外引物为如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述下游外引物为如下(b1)或(b2)；(b1)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(b2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；所述上游内引物为如下(c1)或(c2)；(c1)序列表的序列3所示的单链DNA分子；(c2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；所述下游内引物为如下(d1)或(d2)；(d1)序列表的序列4所示的单链DNA分子；(d2)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子。2.根据权利要求1所述的成套引物，其特征在于：所述上游内引物或所述下游内引物的末端采用生物素标记。3.一种检测草鱼呼肠孤病毒的试剂，由权利要求1或2所述的成套引物和探针组成；所述探针为如下(e1)或(e2)；(e1)序列表的序列5所示的单链DNA分子；(e2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子。4.一种检测草鱼呼肠孤病毒的试剂盒，包括权利要求1或2所述的成套引物或权利要求3所述的试剂。5.权利要求1或2所述的成套引物或权利要求3所述的试剂或权利要求4所述的试剂盒在检测或辅助检测草鱼呼肠孤病毒中的应用；或，权利要求1或2所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖勤，刘露，李慧欣，
申请(专利权)人：北京科弘生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11