环介导等温扩增结合侧向流动试纸条法检测鲤春病毒血症病毒制造技术

本发明专利技术公开了一种环介导等温扩增结合侧向流动试纸条法检测鲤春病毒血症病毒。本发明专利技术提供了环介导等温扩增成套引物，由上游外引物、下游外引物、上游内引物和下游内引物组成；所述上游外引物的核苷酸序列为序列1；所述下游外引物的核苷酸序列为序列2；所述上游内引物的核苷酸序列为序列3；所述下游内引物的核苷酸序列为序列4。本发明专利技术比现有传统技术PCR检测鲤春病毒血症病毒(SVCV)的方法具有更高的实用性及便捷性，可以在实际野外现场即时检测，有利于预防控制鲤春病毒血症病毒的爆发，对保护我国水产养殖经济发展具有重要意义。

Detection of spring viremia virus in carp by loop mediated isothermal amplification combined with lateral flow test strip method

The invention discloses a loop mediated isothermal amplification combined with a lateral flow test strip method for detecting the spring viremia virus of the carp. The invention provides a loop mediated isothermal amplification primer set, from the upstream and downstream primers outside the outer primers and inner primers upstream and downstream primers in composition; nucleotide sequence of the upstream sequence of 1 outer primers for nucleotide sequence; the outer primers for the downstream sequence of 2 nucleotide sequence; the upstream primer sequence in 3; nucleotide sequence of the downstream primer sequence in 4. The present invention is detection of spring viremia of carp virus existing in the traditional technology of PCR (SVCV) method has higher practicability and convenience, can be detected in the practical field, is conducive to the prevention and control of spring viremia virus outbreak, has important significance for protecting aquaculture economic development in china.

【技术实现步骤摘要】
环介导等温扩增结合侧向流动试纸条法检测鲤春病毒血症病毒
本专利技术涉及病毒检测
，具体涉及一种环介导等温扩增结合侧向流动试纸条法检测鲤春病毒血症病毒。
技术介绍
鲤春病毒血症(Springviraemiaofcarp，SVC)是一种以出血为主要临床症状并伴有高度传染性的急性流行病，其病原为鲤春病毒血症病毒(Springviraemiaofcarpvirus，SVCV)。该病发病急、死亡率高，死亡率可高达90％，严重危害渔业生产，世界动物卫生组织OIE将其列为必须申报的重要疫病。2008年，农业部第1125号公告更是将该病列为“中华人民共和国进境动物一类传染病”，也是唯一一个被列为一类传染病的鱼类疫病，因此成为鱼类口岸检疫的第一类检疫对象。SVCV病毒粒子长90nm～180nm，宽60nm～90nm，有类脂囊膜，核衣壳中空，螺旋状对称，直径50nm。病毒基因组为单股、负链、不分节段的RNA，长约11019个核苷酸，主要包含5个基因:RNA聚合酶蛋白(RNApolymerase,L)、糖蛋白(Glycoprotein,G)、基质蛋白(Matrixprotein,M)、磷蛋白(Phosphoprotein,P)和核蛋白(Nucleoprotein,N)。该病毒对酸、热及脂溶剂敏感，pH值7～10时稳定，在13℃～22℃均可生长，最适生长温度为17℃。SVCV主要危害越冬以后的幼鲤和一龄以上的鲤鱼，死亡率较高。感染途径是以水体为媒介，通过鳃进入鱼体，再通过粪、尿排出体外。外伤也是一个重要的传播途径。无症状的带毒鱼体能持续数周不断地排出病毒，在低水温时病毒能在被感染的鲤鱼血液中保持11周之久，即呈现持续性的病毒血症时期。鲤鱼急性感染时，在临床上表现为病鱼无目的的漂游，体发黑，腹部肿大；皮肤和鳃渗血；消化道出血，可见腹水严重带血，肠炎、心、肾、鳔有时连同肌肉也有出血症状；内脏水肿，肝部血管有血管炎及水肿，导致血管坏死，肝实质坏死。当病鱼出现这种显性感染时，其肾、脾、腮、脑中会含有大量病毒粒子。目前，尚缺乏有效控制SVCV的药物和方法。国际上通行的控制该病的有效措施是进行SVC的监测，及早发现并进行隔离或扑杀。该病的诊断主要依赖于实验室的检测，目前，SVCV的检测方法包括细胞学诊断、免疫学诊断及分子生物学诊断三大类。细胞学诊断技术主要是利用细胞分离培养病毒和电镜观察。该类方法操作繁琐，检测周期长，灵敏度低。免疫学诊断技术主要包括酶联免疫吸附测定(ELISA)和免疫荧光方法。该类方法灵敏度较高，但对抗体要求也高，已有报道表明针对SVCV欧洲株制备的抗体不能用于检测亚洲株。另外，该类方法操作也相对繁琐，大量样本检测工作量巨大。因此，建立快速、简便、灵敏的检测方法是水产养殖业的迫切需要。环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)技术是Notomi等于2000年报道的一种新型等温核酸扩增方法(国际专利公开号WO00/28082)，针对靶基因的6个位点设计4条LAMP引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(BstDNA聚合酶)，在恒温条件下快速、高效、高特异、高灵敏地扩增靶序列，适合于现场和实验条件较简单的实验室进行快捷检测。引入一对环状引物的改进方法，进一步缩短了反应时间。侧向流动试纸条(Lateralflowdipstick，LFD)是一种新的检测方法，反应中羟基荧光素FAM标记的探针与生物素标记的LAMP扩增产物特异性杂交，避免了琼脂糖凝胶电泳或荧光染料染色肉眼观察由非特异性扩增造成的假阳性，进一步提高了反应的特异性和灵敏度。LFD检测无需特殊的设备，操作者只需取10μL反应产物滴到点样孔内，之后于点样处前端滴加100μL缓冲液，静置3-5分钟，肉眼观察即可。且不需有毒试剂，操作简便且更安全。LAMP-LFD结合技术的检测结果可以直接肉眼观察。LFD试纸条上具有质控带和检测带，两条带均显色表示检测结果为阳性，只有质控带显色检测带不显色表明检测结果为阴性。LAMP-LFD结合方法安全、快捷、高效、高灵敏度，且无设备及技术限制，具有其他技术所无法替代的优势。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种环介导等温扩增结合侧向流动试纸条法检测鲤春病毒血症病毒。本专利技术提供的一种检测鲤春病毒血症病毒的环介导等温扩增成套引物，由上游外引物、下游外引物、上游内引物和下游内引物组成；所述上游外引物为如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述下游外引物为如下(b1)或(b2)；(b1)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(b2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；所述上游内引物为如下(c1)或(c2)；(c1)序列表的序列3所示的单链DNA分子；(c2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；所述下游内引物为如下(d1)或(d2)；(d1)序列表的序列4所示的单链DNA分子；(d2)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子。上述成套引物中，所述上游内引物或所述下游内引物的末端采用生物素标记。上述成套引物中，所述上游内引物的末端采用生物素标记。上述成套引物中，所述上游内引物的5'末端采用生物素标记。上述成套引物中，所述上游外引物、所述下游外引物、所述上游内引物和所述下游内引物的摩尔比为1:1:8:8。本专利技术第2个目的是提供一种检测鲤春病毒血症病毒的试剂，由上述的成套引物和探针组成；所述探针为如下(e1)或(e2)；(e1)序列表的序列5所示的单链DNA分子；(e2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子。所述探针的末端采用羟基荧光素FAM标记。所述探针的5'末端采用羟基荧光素FAM标记。本专利技术第3个目的是提供一种检测鲤春病毒血症病毒的试剂盒，包括上述的成套引物或上述的试剂。上述的成套引物或上述的试剂或上述的试剂盒在检测或辅助检测鲤春病毒血症病毒中的应用也是本专利技术保护的范围。上述的成套引物或上述的试剂或上述的试剂盒在制备检测或辅助检测鲤春病毒血症病毒产品中的应用也是本专利技术保护的范围。上述的成套引物或上述的试剂或上述的试剂盒在检测或辅助检测待测样本是否感染鲤春病毒血症病毒中的应用也是本专利技术保护的范围。上述的成套引物或上述的试剂或上述的试剂盒在制备检测或辅助检测待测样本是否感染鲤春病毒血症病毒产品中的应用也是本专利技术保护的范围。本专利技术第4个目的是提供一种检测或辅助检测待测样本是否感染鲤春病毒血症病毒的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤：1)提取待测样本的总RNA，反转录为cDNA；以所述cDNA为模板，采用上述的成套引物进行环介导等温扩增，得到环介导等温扩增产物；2)用上述的试剂中的所述探针杂交所述环介导等温扩增产物，得到杂交产物；3)采用侧向流动试纸条检测所述杂交产物，若所述试剂条的质控带和检测带均显色，则所述待测样本感染或候选感染鲤春病毒血症病毒，若所本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测鲤春病毒血症病毒的环介导等温扩增成套引物，由上游外引物、下游外引物、上游内引物和下游内引物组成；所述上游外引物为如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述下游外引物为如下(b1)或(b2)；(b1)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(b2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；所述上游内引物为如下(c1)或(c2)；(c1)序列表的序列3所示的单链DNA分子；(c2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；所述下游内引物为如下(d1)或(d2)；(d1)序列表的序列4所示的单链DNA分子；(d2)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子。

【技术特征摘要】
1.一种检测鲤春病毒血症病毒的环介导等温扩增成套引物，由上游外引物、下游外引物、上游内引物和下游内引物组成；所述上游外引物为如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述下游外引物为如下(b1)或(b2)；(b1)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(b2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；所述上游内引物为如下(c1)或(c2)；(c1)序列表的序列3所示的单链DNA分子；(c2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；所述下游内引物为如下(d1)或(d2)；(d1)序列表的序列4所示的单链DNA分子；(d2)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子。2.根据权利要求1所述的成套引物，其特征在于：所述上游内引物或所述下游内引物的末端采用生物素标记。3.一种检测鲤春病毒血症病毒的试剂，由权利要求1或2所述的成套引物和探针组成；所述探针为如下(e1)或(e2)；(e1)序列表的序列5所示的单链DNA分子；(e2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子。4.一种检测鲤春病毒血症病毒的试剂盒，包括权利要求1或2所述的成套引物或权利要求3所述的试剂。5.权利要求1或2所述的成套引物或权利要求3所述的试剂或权利要求4所述的试剂盒在检测或辅助检测鲤春病毒血症病毒中的应用；或，权利要求1或2所述的成...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖勤，刘露，王建梅，李慧欣，
申请(专利权)人：北京科弘生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11