用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂、检测方法和应用技术

本申请公开了一种用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂、检测方法和应用。本申请用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂，包括引物对和探针，引物对上/下游引物分别为Seq ID No.1和Seq ID No.2所示序列，探针为Seq ID No.3所示序列或其反向互补序列；探针中，第27个碱基修饰BHQ1‑dT，第30个碱基修饰6‑FAM‑dT，第28个碱基替换为dSpacer，3’端修饰C3Spacer。本申请的H5亚型检测试剂，能准确灵敏的从众多禽流感病毒中特异性检测出H5亚型，为H5亚型防控提供了一种有效的方法和途径。本申请的检测方法，耗时短、灵敏度高、硬件设备要求低，不需复杂的样本处理，特别适合现场快速检测。

Reagents, detection methods and applications for detection of H5 subtype avian influenza virus

A reagent, detection method and application for detection of H5 subtype avian influenza virus are disclosed in this paper. The application kit for detection of H5 subtype avian influenza virus, including primers and probes, primers / downstream primers were Seq ID and Seq No.1 ID No.2 shown in sequence, as shown by Seq ID probe No.3 sequence or its reverse complementary sequence; probe, twenty-seventh bases BHQ1 dT, thirtieth FAM dT 6 modified bases, twenty-eighth base substitutions for dSpacer, 3 'C3Spacer. This H5 subtype detection reagent can accurately and sensitively follow the specific subtype of avian influenza virus detected H5 subtype, and provide an effective method and approach for the prevention and control of H5 subtype. The detection method of this application is short time, high sensitivity, low hardware equipment, no complex sample processing, especially suitable for on-site rapid detection.

【技术实现步骤摘要】
用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂、检测方法和应用
本申请涉及禽流感病毒检测领域，特别是涉及一种用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂、检测方法和应用。
技术介绍
自1996年H5N1高致病性禽流感在我国广东地区发生以来，该病毒所感染的宿主范围越来越广，包括了很多的鸟类、哺乳动物甚至人类。H5N1病毒不仅给许多国家的养禽业带来了沉重打击，同时也向全人类的健康提出了严峻挑战。2004年开始，韩国、越南、中国、日本等多个亚洲国家相继发生高致病性H5N1亚型禽流感疫情。此后，病毒扩散范围逐步扩大，欧洲、中东及非洲地区也相继出现疫情，目前该亚型病毒已传播到全世界范围内的60多个国家。1997年，被认为只局限于禽类宿主中存在的H5N1亚型禽流感病毒，却造成了人类的感染并能够引起死亡，这也是全世界首例不需要中间宿主而使人直接感染禽流感病毒的事件。此后人感染H5N1亚型流感病例时有发生，截至2017年2月14日，H5N1亚型禽流感病毒已在全世界范围内16个国家造成共856例感染病例，其中死452例。虽然目前H5N1禽流感病毒还没有获得在人与人之间的高效传播的能力，但是病毒表面HA基因不断变异，内部基因频繁重组，大大加快了该病毒的遗传进化和传播扩散，使其宿主范围不断扩大的同时对人类的安全威胁也越来越大。H5亚型高致病性禽流感病毒除了H5N1亚型之外，还存在多种其他NA亚型病毒，目前我国H5亚型高致病性禽流感呈现了H5N1、H5N2、H5N6和H5N8等多个血清亚型的毒株同时在禽群中流行的特点。2014年以来我国H5亚型高致病性禽流感主要流行的亚型为H5N6亚型，2014年我国四川也出现了首例人感染H5N6亚型禽流感病例。H5亚型禽流感病毒的基因型也不断发生着变化，从早期的0分支发展进化为目前多分支同时存在的局面，我国当前主要流行2.3.4.4分支和2.3.2.1分支毒株，每个进化分支又分化为多个小分支，这为H5亚型禽流感病毒的早期检测和防控带来挑战。重组酶聚合酶核酸扩增技术RPA(RecombinasePolymeraseAmplification，RPA)被称为是可以替代PCR的核酸检测技术，RPA能够在15分钟内进行37℃-42℃常温的单分子核酸扩增。RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，其扩增原理是：重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。目前尚没有H5亚型禽流感病毒的RPA检测研究和报道。
技术实现思路
本申请的目的是提供一种用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂、检测方法和应用。本申请采用了以下技术方案：本申请的一方面公开了一种用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂，该试剂包括引物对和探针，引物对的上游引物为SeqIDNo.1所示序列，引物对的下游引物为SeqIDNo.2所示序列，探针为SeqIDNo.3所示序列或者SeqIDNo.3所示序列的反向互补序列；SeqIDNo.1：5’-GACTACAGCTTAGGGATAATGCAAAGGAGCTGGG-3’SeqIDNo.2：5’-CTTTTTAATCTTGCTTCTTCTGAATACTG-3’SeqIDNo.3：5’-GGTTGTTTCGAGTTCTATCACAAATGTGATAATGAATGTATGGAAAGTG-3’SeqIDNo.3所示序列的探针中，第27个碱基修饰BHQ1-dT，第30个碱基修饰6-FAM-dT，第28个碱基替换为dSpacer，3’端修饰C3Spacer。需要说明的是，在荧光检测中，探针是特异性的结合到双链的其中一条链的，只要PCR扩增的时候，将结合的探针破坏，即可产生荧光信号，因此，可以采用SeqIDNo.3所示序列的探针结合到其中一条链上，也可以采用SeqIDNo.3所示序列的反向互补序列作为探针结合到另一条链上，探针的修饰方式不变。还需要说明的是，本申请的引物对和探针，是特别针对H5亚型禽流感病毒的RPA检测而设计的，不同于常规PCR引物或一般的实时荧光PCR探针。此外，本申请的引物对和探针能够特异性的检测H5亚型禽流感病毒，虽然目前已经有关于H5N8、H5N6等致病毒株的特异性检测方法，但是，考虑到H5亚型禽流感病毒分支庞大，而危害性强，如果单独对其中个别毒株进行检测，一方面，容易存在漏检，另一方面，每个毒株采用一套试剂检测，成本高，且工作量大；因此，本申请特别研制了针对H5亚型禽流感病毒的特异性引物对和探针，能够对所有H5亚型禽流感病毒的毒株进行特异性检测，包括H5N8、H5N6等毒株；这对H5亚型禽流感病毒的早期检测和防控具有重要意义。可以理解，在本申请的基础上，还可以进一步的采用H5N8、H5N6等致病毒株的特异性检测方法，对H5亚型禽流感病毒的具体毒株进行鉴定，以方便后续进行针对性的整治，在此不做具体限定。本申请的试剂包括引物对和探针，其中，探针是为了方便对RPA产物进行荧光检测，可以理解，如果不是采用荧光检测对RPA产物进行检测，则整个试剂可以不包含探针，只要一对引物即可完成RPA扩增。本申请的另一面公开了本申请的用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂在H5亚型禽流感病毒检测中的应用。本申请的另一面公开了本申请的用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂在制备H5亚型禽流感病毒检测试剂盒或设备中的应用。可以理解，本申请的试剂，实际上就针对H5亚型禽流感病毒设计的特异性探针和引物对，当然可以用于H5亚型禽流感病毒的检测，或者用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂盒或设备。本申请的再一面公开了一种用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂盒，该试剂盒中含有本申请的用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂。本申请的再一面公开了一种用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂盒，该试剂盒中含有至少一组混合试剂，每组混合试剂由RT-RPA反应缓冲液29.5μL、10μM的上游引物2.1μL、10μM的下游引物2.1μL和10μM的探针0.6μL组成；上游引物为SeqIDNo.1所示序列，下游引物为SeqIDNo.2所示序列，探针为SeqIDNo.3所示序列或者SeqIDNo.3所示序列的反向互补序列，并且，No.3所示序列的探针中，第27个碱基修饰BHQ1-dT，第30个碱基修饰6-FAM-dT，第28个碱基替换为dSpacer，3’端修饰C3Spacer。需要说明的是，本申请的试剂实际上是针对H5亚型禽流感病毒的RPA检测而设计的，为了方便使用，本申请将反应体系中使用的反应缓冲液、引物和探针统一配制成混合试剂，每一组混合试剂就是一个反应体系，直接向其中加入RNA样品、水和/或添加剂就可以进行检测，使用简单方便，不仅避免了配制反应体系的繁琐步骤，而且避免了配制反应体系过程造成的污染。本申请试剂盒的混合试剂中，各组分的用量是在本申请的试验条件和环境下，根据本申请的优选实施方式而得出的，可以本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂，其特征在于：所述试剂包括引物对和探针，所述引物对的上游引物为Seq ID No.1所示序列，所述引物对的下游引物为Seq ID No.2所示序列，所述探针为Seq ID No.3所示序列或者Seq ID No.3所示序列的反向互补序列；Seq ID No.1：5’‑GACTACAGCTTAGGGATAATGCAAAGGAGCTGGG‑3’Seq ID No.2：5’‑CTTTTTAATCTTGCTTCTTCTGAATACTG‑3’Seq ID No.3：5’‑GGTTGTTTCGAGTTCTATCACAAATGTGATAATGAATGTATGGAAAGTG‑3’Seq ID No.3所示序列的探针中，第27个碱基修饰BHQ1‑dT，第30个碱基修饰6‑FAM‑dT，第28个碱基替换为dSpacer，3’端修饰C3 Spacer。

【技术特征摘要】
1.一种用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂，其特征在于：所述试剂包括引物对和探针，所述引物对的上游引物为SeqIDNo.1所示序列，所述引物对的下游引物为SeqIDNo.2所示序列，所述探针为SeqIDNo.3所示序列或者SeqIDNo.3所示序列的反向互补序列；SeqIDNo.1：5’-GACTACAGCTTAGGGATAATGCAAAGGAGCTGGG-3’SeqIDNo.2：5’-CTTTTTAATCTTGCTTCTTCTGAATACTG-3’SeqIDNo.3：5’-GGTTGTTTCGAGTTCTATCACAAATGTGATAATGAATGTATGGAAAGTG-3’SeqIDNo.3所示序列的探针中，第27个碱基修饰BHQ1-dT，第30个碱基修饰6-FAM-dT，第28个碱基替换为dSpacer，3’端修饰C3Spacer。2.根据权利要求1所述的用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂在H5亚型禽流感病毒检测中的应用。3.根据权利要求1所述的用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂在制备H5亚型禽流感病毒检测试剂盒或设备中的应用。4.一种用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有权利要求1所述的用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂。5.一种用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有至少一组混合试剂，每组混合试剂由RT-RPA反应缓冲液29.5μL、10μM的上游引物2.1μL、10μM的下游引物2.1μL和10μM的探针0.6μL组成；所述上游引物为SeqIDNo.1所示序列，所述下游引物为SeqIDNo.2所示序列，所述探针为SeqIDNo.3所示序列或...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾伟新，曹琛福，廖明，花群义，林彦星，谢淑敏，
申请(专利权)人：华南农业大学，深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：广东,44