一种基于PEDV M基因的RT-LAMP引物组合物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基于PEDV M基因的RT‑LAMP引物组合物及其应用，所述引物组合物包括：外引物F3和B3、内引物FIP和BIP以及环引物LF和LB，所述的外引物序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述的内引物序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，所述的环引物序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。本发明专利技术提供的引物组合物检测PEDV M基因具有操作简单，耗时少的特点，且具有很好的准确性。

A RT-LAMP primer composition based on PEDV M gene and its application

The invention discloses a RT LAMP primer composition based on the PEDV M gene and its application. The primer compositions include the outer primers F3 and B3, the primers FIP and BIP, and the ring primers LF and LB. It is shown that the ring primer sequences are shown as SEQ ID No.5 and SEQ ID No.6. The primer composition provided by the invention has the advantages of simple operation and less time consumption for detecting the PEDV M gene, and has good accuracy.

【技术实现步骤摘要】
一种基于PEDVM基因的RT-LAMP引物组合物及其应用
本专利技术属于微生物检测
，具体涉及一种基于PEDVM基因的RT-LAMP引物组合物及其应用。
技术介绍
猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)是引起当前全球仔猪腹泻死亡的主要病原，以仔猪呕吐、严重腹泻和脱水死亡为主要特征。该病于1971年在英国首次报道，随后很快在加拿大、德国、法国等世界各养猪国发现，我国于1984年确认感染，并于2010年在全国猪场大爆发，损失仔猪数千万头。美国于2013年报道出现PEDV大规模爆发疫情，初生仔猪死亡率100％，损失仔猪约700万头。近年来，随着PEDV疫苗的使用和猪场生物安全体系的不断完善，PEDV引起的疫情总体上有所减缓，但相当数量的猪场带毒及散发仍然十分严重，该病仍然是当前造成养猪业经济损失的关键因素之一，如何在早期快速、简便的确诊猪群是否带毒以及排毒规律以便提前做好防控措施是控制和降低该病经济损失的关键。目前，对该病的诊断主要有病毒分离、免疫组化、免疫荧光、原位杂交、ELISA或RT-PCR等方法，但这些诊断方法普遍存在耗时长、成本高、对设备要求高等缺点，不利于临床快速、简便、准确的确诊和应用，从而延误疫病的最佳处理时机。环介导恒温扩增技术(LAMP)是一种在恒温反应条件下利用特异性引物和扩增酶的协助对模板进行周而复始扩增的一种快速诊断技术。该技术以其灵敏度高、特异性强、反应时间短、操作简单等特点，很快在疾病流行病学监测、病原诊断、食品安全检测等领域得到了广泛的应用。逆转录LAMP(RT-LAMP)是指在RNA病毒反应体系中加入逆转录酶来实现一步扩增的环介导恒温扩增技术。近年来，该技术已广泛运用于病原体检测中。
技术实现思路
本专利技术提供了一种PEDV的RT-LAMP引物组合物，以及快速检测方法，同时还可将引物组合物制备成快速检测的试剂盒，本专利技术基于RT-LAMP技术原理，针对PEDVM基因设计6条特异性引物，建立PEDVRT-LAMP快速检测方法，为PEDV的快速诊断和综合防控提供更好的技术支持。本专利技术具体通过以下技术方案来实现：一种基于PEDVM基因的RT-LAMP引物组合物，所述引物组合物包括：外引物F3和B3、内引物FIP和BIP以及环引物LF和LB，所述的外引物序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示，所述的内引物序列如SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示，所述的环引物序列如SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示。优选的，所述的引物还包括将F3、B3、FIP、BIP、LF和LB引物序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后具有与上述序列具有相同功能的DNA分子。本专利技术提供了上述引物组合物在RT-LAMP方法中用以检测猪流行性腹泻病毒M基因的应用。所述的引物组合物在RT-LAMP方法中，引物组合物F3、B3、FIP、BIP、LF和LB的摩尔浓度比为1：1：4：4：2：2。所述的RT-LAMP的反应条件为60℃水浴锅恒温水浴30min；80℃10min终止反应。本专利技术还提供了上述引物组合物在制备检测猪流行性腹泻病毒M基因试剂盒中的应用。所述试剂盒的制备方法包括将各条引物单独包装的步骤。一种用于检测猪流行性腹泻病毒M基因的试剂盒，所述的试剂盒通过RT-LAMP方法进行检测，所述的试剂盒包含SEQIDNo.1～6所示引物。本专利技术的有益效果为：本专利技术针对PEDV的M基因片段设计六条引物，利用RT-LAMP技术可快速实现对猪流行性腹泻病毒M基因的检测，经试验证明本专利技术技术耗时短，全程恒温，无需大型精密仪器，可在养猪场或者小型房间完成。减少了样品中病原物质降解的可能，整个过程操作简单，结果检出方便，所以也无需极其专业的人员来操作，适合大规模推广使用。附图说明图1是本专利技术PEDV的PCR扩增结果图；图2是本专利技术PEDV-LAMP检测结果图；其中A:目视显色图；B:紫外荧光显色图；C:电泳图；1:阴性对照；2:阳性结果；M:MarherD2000；图3是10×Thermopol缓冲液(2mM)优化结果图；其中A:目视显色图；B:紫外荧光显色图；C:电泳图；1:阴性对照；2:3μL10×Thermopol缓冲液(2mM)；3:2.5μL10×Thermopol缓冲液(2mM)；4:2μL10×Thermopol缓冲液(2mM)；5:1.5μL10×Thermopol缓冲液(2mM)；M:MarherD2000；图4是MgSO4(6mM)优化结果图；A:目视显色图；B:紫外荧光显色图；C:电泳图；M:MarherD2000；1:1.0μLMgSO4(6mM)；2:1.5μLMgSO4(6mM)；3:2μLMgSO4(6mM)；4:2.5μLMgSO4(6mM)；图5是dNTP的优化结果图；A:目视显色图；B:紫外荧光显色图；C:电泳图；1：阴性对照；2:2.5μLdNTP混合液(1.4mM)；3:3.0μLdNTP混合液(1.4mM)；4:3.5μLdNTP混合液(1.4mM)；5:4.0μLdNTP混合液(1.4mM)；M:MarherD2000；图6是引物比例的优化结果图；A:目视显色图；B:紫外荧光显色图；C:电泳图；1：阴性对照；2：引物比例1：1；3：引物比例1：2；4：引物比例1：4；5：引物比例1：8；M:MarherD2000；图7是cDNA模板的优化结果图；A:目视显色图；B:紫外荧光显色图；C:电泳图；M:MarherD2000；1：阴性对照；2：0.25μLcDNA模板；3：0.5μLcDNA模板；4：1.0μLcDNA模板；5：2.0μLcDNA模板；图8是反应温度的优化结果图；A:目视显色图；B:紫外荧光显色图；C:电泳图；M:MarherD2000；1：阴性对照；2：59℃；3：61℃；4：63℃；5：65℃；图9是反应时间的优化结果图；A:目视显色图；B:紫外荧光显色图；C:电泳图；M:MarherD2000；1:1h63℃；2：50min63℃；3：40min63℃；4：30min63℃；图10是反应体系的优化结果电泳图；M:MarherD2000；1-7：阳性结果图8：阴性对照图；图11是RT-LAMP的结果图；A:目视显色图；B:紫外荧光显色图；C:电泳图；M:MarherD2000；1:阴性对照；2：样品结果；图12是10份粪便样品的LAMP和RT-PCR结果图；A：PEDV的LAMP扩增结果；B：PEDV的RT-PCR扩增结果图；M:MarherD20001-10：样品编号分别为8、12、14、20、24、25、26、28、29、20；图13是10份小肠样品的LAMP和RT-PCR结果图；A：PEDV的LAMP扩增结果；B：PEDV的RT-PCR扩增结果图；M:MarherD2000；126789：阴性；24510：阳性；图14是两份正常、10份初乳、两份血样的LAMP和RT-PCR结果图；A：PEDV的LAMP扩增结果；B：PEDV的RT-PCR扩增结果图；M:MarherD2000；1，2：正常样品；3-12：疑似患病猪初乳；13，14：血样。具体实施方式下面将结合本专利技术具体的实施例，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于PEDV M基因的RT‑LAMP引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括：外引物F3和B3、内引物FIP和BIP以及环引物LF和LB，所述的外引物序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述的内引物序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，所述的环引物序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。

【技术特征摘要】
1.一种基于PEDVM基因的RT-LAMP引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括：外引物F3和B3、内引物FIP和BIP以及环引物LF和LB，所述的外引物序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示，所述的内引物序列如SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示，所述的环引物序列如SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示。2.根据权利要求1所述的一种基于PEDVM基因的RT-LAMP引物组合物，其特征在于，所述的引物组合物包括将F3、B3、FIP、BIP、LF和LB引物序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后具有与上述序列具有相同功能的DNA分子。3.权利要求1所述的引物组合物在RT-LAMP方法中用...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈希文，尹苗，杨凤，杨勤，汪谦，龙洁，郑姚，廖晨晨，
申请(专利权)人：绵阳师范学院，
类型：发明
国别省市：四川,51