一种用于检测大麦黄花叶病毒的LAMP引物组及检测方法技术

一种用于检测大麦黄花叶病毒的LAMP引物组及检测方法，根据Genbank中查找到的BaYMV基因的CP序列进行引物设计，获得LAMP引物组，其包括外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，该LAMP引物组特异性强，减少了非靶标序列的影响，可以识别目的序列上6个不同的区域，具有高度的选择性，灵敏度高，检测方法具有反应条件简单、操作简便快速、结果判定方便、准确等优点，可用于环介导逆转录等温扩增，通过添加显色剂用肉眼来直接观察检测结果，在保证实验结果准确性的同时，更加经济节约，高效，易于推广。

A LAMP primer set for detection of barley yellow mosaic virus and its detection method

A LAMP primer group and detection method used to detect the barley yellow mosaic virus, and primer design based on the CP sequence of the BaYMV gene found in Genbank. The LAMP primer group was obtained, including the primer F3 and B3, the primer FIP and BIP, the LAMP primer group was highly specific and reduced the effect of the non target sequence and could identify the order. The 6 different regions have high selectivity and high sensitivity. The detection method has the advantages of simple reaction conditions, simple and rapid operation, convenient and accurate results. It can be used for loop mediated reverse transcriptase isothermal amplification and direct connection of the detection results with the naked eye to ensure the experimental results. At the same time, it is more economical, efficient and easy to popularize.

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测大麦黄花叶病毒的LAMP引物组及检测方法
本专利技术属于植物病毒检测
，具体涉及一种用于检测大麦黄花叶病毒的LAMP引物组及检测方法。
技术介绍
大麦黄花叶病主要是由大麦黄花叶病毒引起，借助于土壤中的禾谷多黏菌进行传播。上个世纪40年代日本首次对该病毒报道以来，已经在欧亚多个国家发现了该病毒的广泛分布。我国于上世纪50年代首次在浙江珠海农场发现大麦黄花叶病，因未重视，于上世纪70年代在我国长江流域大麦产区大规模爆发，造成了严重的危害。目前，黄花叶病毒的检测方法有很多，包括电镜法、酶联免疫法(ELISA)、RT-PCR法、定量PCR和TaqMan探针法，等等。这些方法要么需要昂贵的仪器设备和复杂的操作方法，要么存在抗体制备难和假阳性的问题。大麦黄花叶病毒是一种RNA病毒，属于马铃薯Y病毒科大麦黄花叶病毒属，其基因组由两个RNA分子RNA1和RNA2组成，分别约为7.6kb和3.5kb，这两个RNA分子被包被在一个丝状衣壳蛋白中形成大麦黄花叶病毒粒子(Chenetal.,1999)。RNA1编码8个蛋白，包括RNA依赖的RNA聚合酶，基因组连接蛋白，衣壳蛋白，丝氨酸蛋白酶等；RNA2编码两个蛋白，分别为半胱氨酸蛋白酶和假定的载体感染因子(YouandShirako,2013)。环介导到等温扩增法(LAMP)具备特异性强、操作简单、时间短、观察方便等优点，在病毒检测中发挥着重要的作用，目前，LAMP技术在我国还未被应用于大麦黄花叶病毒的检测。利用LAMP技术检测大麦黄花叶病毒的难点在于保守序列的选择和引物的设计，方法灵敏度较高时，还需要严格的防污染措施来避免假阳性结果。
技术实现思路
本专利技术提供一种用于检测大麦黄花叶病毒的LAMP引物组及检测方法，引物组由内外两对引物组成，具有高度的特异性，灵敏度高，可清晰检测植物RNA稀释浓度为0.001ng/μL中的病毒，具有高度的选择性，检测方法具有反应条件简单、操作简便快速、结果判定方便、准确等优点。为了达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种用于检测大麦黄花叶病毒的LAMP引物组，其包括外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，从5’端到3’端，具体序列如下：F3:5’-CGCAACTACAGTGATGAAAC-3’；B3:5’-TCGGAAGTTAACATGGTGTT-3’；FIP:5’-GAAGCGCCATGCTTCATTGATTTTCGTCTTACTCATCACAAACAAC-3’；BIP:5’-CGATTTCTTCGTCCCACGATCATTTTTCAGTTCCAAGTGCTGCTA-3’。本专利技术提供一种包含所述LAMP引物组的大麦黄花叶病毒的LAMP检测试剂盒。进一步，所述LAMP检测试剂盒包含LAMP反应体系，该LAMP反应体系包括：内引物FIP、内引物BIP、外引物F3、外引物B3、buffer、dNTP、甜菜碱和BstDNA聚合酶。进一步，所述的LAMP反应体系中，各成分的终浓度为：内引物FIP为0.2-1.6μM，内引物BIP为0.2-1.6μM，外引物F3为0.1-1.6μM，外引物B3为0.1-1.6μM，dNTPs为0.2-0.4mM、甜菜碱为0.4-0.8M，DNA聚合酶Bst为0.16-1U/μL。优选地，所述LAMP反应体系中，各成分的终浓度为：内引物FIP为0.8μM，内引物BIP为0.8μM，外引物F3为0.8μM，外引物B3为0.8μM，dNTPs为0.3mM、甜菜碱为0.6M，DNA聚合酶Bst为0.32U/μL。进一步，所述LAMP反应体系中，还含有大麦黄花叶病毒目标片段质粒的阳性模板。一种大麦黄花叶病毒的LAMP检测方法，包括以下步骤：1)提取待测样品RNA，进行反转录，获得cDNA；2)配制LAMP反应体系；所述LAMP反应体系中，各成分的终浓度为：内引物FIP为0.2-1.6μM，内引物BIP为0.2-1.6μM，外引物F3为0.1-1.6μM，外引物B3为0.1-1.6μM，dNTPs为0.2-0.4mM、甜菜碱为0.4-0.8M，DNA聚合酶Bst为0.16-1U/μL；3)进行LAMP扩增反应利用步骤2)的LAMP反应体系，对步骤1)获得的cDNA进行LAMP扩增，以ddH2O为阴性对照，以包含大麦黄花叶病毒目标序列的质粒为阳性对照，获得对应的扩增产物；LAMP扩增反应的程序为：55-65℃，30-60min，80-85℃3-5min；4)鉴定扩增结果步骤3)LAMP扩增反应结束后，向各扩增产物中加入SYBRGreenI染料，观察颜色变化：阳性对照显色为绿色，阴性对照显色为橘色；待测样品显色为绿色的样品为阳性，含有大麦黄花叶病毒，显色为橘色的样品为阴性，不含大麦黄花叶病毒。进一步，在所述的LAMP反应体系中，各成分的终浓度为：内引物FIP为0.8μM，内引物BIP为0.8μM，外引物F3为0.8μM，外引物B3为0.8μM，dNTPs为0.3mM，甜菜碱为0.6M，DNA聚合酶Bst为0.32U/μL。将本专利技术所述的LAMP引物用于大麦黄花叶病毒的RT-LAMP检测方法中。进一步，所述RT-LAMP检测方法中，以大麦黄花叶病毒RNA为模板，反应体系中各成分的终浓度为：内引物FIP为0.2-1.6μM，内引物BIP为0.2-1.6μM，外引物F3为0.1-1.6μM，外引物B3为0.1-1.6μM，dNTPs为0.2-0.4mM、甜菜碱为0.4-0.8M，DTT为0.1-10mM，逆转录酶ReverTraAce为1-5U/μL，DNA聚合酶Bst为0.16-1U/μL，待测样品RNA0.001ng/μL-100ng/μL，反应程序为：60-65℃30-60min，80-85℃3-5min。本专利技术的LAMP或RT-LAMP反应体系中，buffer中含镁离子，10×buffer的添加遵循本领域中的常规添加原则，通常为反应总体积的十分之一。本专利技术对大麦黄花叶病毒(BaYMV)的衣壳蛋白基因(coatproteingene，CP)序列(GenBank登录号为KC999959.1)进行查找，共计获得12条相关序列，通过比对，选择长度为211bp的共同保守区段为目标序列，在序列完全一致的区域，设计2对引物，分别为：外引物对F3和B3，内引物对FIP和BIP，内引物长度分别为46bp和45bp，具有长片段引物的特点，两对引物组成的扩增反应体系，使扩增高度特异性。本专利技术对LAMP反应温度和体系进行了详尽、可靠的研究。本专利技术对大麦黄花叶病毒的LAMP反应温度设在55℃-65℃之间，在该温度范围内，LAMP反应效率和产物产量较高，该温度的设定还考虑了反转录所需的温度因素，因此，该温度条件还适于进行RT-LAMP反应；本专利技术对内引物及外引物的用量进行了摸索，最终确定内引物与外引物的使用浓度，内引物FIP为0.2-1.6μM，内引物BIP为0.2-1.6μM，外引物F3为0.1-1.6μM，外引物B3为0.1-1.6μM；对模板、dNTP、Betaine、BstDNAPolymerase采用四种因素三水平的正交实验设计进行反应条件的优化，确定了各物质合适的用量。利用本专利技术的LAMP引物组，可以直接采用样品中提取的总本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测大麦黄花叶病毒的LAMP引物组，其包括外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，从5’端到3’端，具体序列如下：F3:5’‑CGCAACTACAGTGATGAAAC‑3’；B3:5’‑TCGGAAGTTAACATGGTGTT‑3’；FIP:5’‑GAAGCGCCATGCTTCATTGATTTTCGTCTTACTCATCACAAACAAC‑3’；BIP:5’‑CGATTTCTTCGTCCCACGATCATTTTTCAGTTCCAAGTGCTGCTA‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测大麦黄花叶病毒的LAMP引物组，其包括外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，从5’端到3’端，具体序列如下：F3:5’-CGCAACTACAGTGATGAAAC-3’；B3:5’-TCGGAAGTTAACATGGTGTT-3’；FIP:5’-GAAGCGCCATGCTTCATTGATTTTCGTCTTACTCATCACAAACAAC-3’；BIP:5’-CGATTTCTTCGTCCCACGATCATTTTTCAGTTCCAAGTGCTGCTA-3’。2.一种包含权利要求1所述LAMP引物组的大麦黄花叶病毒的LAMP检测试剂盒。3.如权利要求2所述LAMP检测试剂盒，其特征在于，包含LAMP反应体系，该LAMP反应体系包括：内引物FIP、内引物BIP、外引物F3、外引物B3、buffer、dNTPs、甜菜碱和DNA聚合酶Bst。4.如权利要求2所述LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述LAMP反应体系中，各成分的终浓度为：内引物FIP为0.2-1.6μM，内引物BIP为0.2-1.6μM，外引物F3为0.1-1.6μM，外引物B3为0.1-1.6μM，dNTPs为0.2-0.4mM、甜菜碱为0.4-0.8M，DNA聚合酶Bst为0.16-1U/μL。5.如权利要求2所述LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述的LAMP反应体系中，各成分的终浓度为：内引物FIP为0.8μM，内引物BIP为0.8μM，外引物F3为0.8μM，外引物B3为0.8μM，10×buffer，dNTPs为0.3mM、甜菜碱为0.6M，DNA聚合酶Bst为0.32U/μL。6.如权利要求2所述LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述LAMP反应体系中，还含有大麦黄花叶病毒的阳性质粒模板。7.一种大麦黄花叶病毒的LAMP检测方法，包括以下步骤：1)提取待测样品总RNA，进行反转录，获得cDNA；2)配制LAMP反应体系；所述LAMP反应体系中，各成分的终浓度为：内引物FIP为0.2-1.6μM，内引物BI...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈志伟，赵凯，毛水花，陆瑞菊，刘成洪，黄剑华，宗迎杰，张述伟，杜亚楠，范小瑞，姜琪，张琪，张晓霞，张皖静，吴文静，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：上海,31