一种鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术提供了一种鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒及其检测方法，该鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒，包括：裂解液、扩增反应混合液、阴性对照和阳性对照；其中，所述裂解液的成分为DNAiso Reagent；所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、PCR Buffer、dNTP、APV‑F上游引物、APV‑R下游引物和rTaq DNA聚合酶；所述阴性对照为灭菌三蒸水；所述阳性对照为鸟类多瘤病毒阳性质粒。该试剂盒灵敏度高、特异性好、稳定性高、结果直观，其检测方法易于操作、方便快捷，能大幅缩短检测时间，为临床控制鸟类多瘤病毒感染提供有力的技术手段，尤其在鹦鹉鸟类多瘤病毒感染快速诊断方面有重要作用。

PCR diagnostic kit for avian multi tumor virus and its detection method

The invention provides a bird multi tumor virus PCR diagnostic kit and its detection method, the avian poly virus PCR diagnostic kit, including: lysate, amplification reaction mixture, negative control and positive control; the component of the lysate is DNAiso Reagent, and the amplified reaction mixture contains sterilizing three steaming. Water, PCR Buffer, dNTP, APV F upstream primers, APV R downstream primers and rTaq DNA polymerase, and the negative control was sterilized three water, and the positive control was the positive plasmid of bird multi tumor virus. The kit has high sensitivity, good specificity, high stability and intuitionistic results. The detection method is easy to operate, convenient and quick, and can shorten the detection time greatly. It provides a powerful technical means for the clinical control of avian multi tumor virus infection, especially in the rapid diagnosis of parrot bird virus infection.

【技术实现步骤摘要】
一种鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒及其检测方法
本专利技术涉及动物医学动物疫病分子生物学诊断
，具体涉及一种鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒及其检测方法。
技术介绍
鸟类多瘤病毒(AvianPolyomaVirus，APV)首先在虎皮鹦鹉感染病例中发现，又名法兰西斯掉羽症。感染的虎皮鹦鹉主要症状是腹部及背部长不出绒羽。后来又陆续发现金刚鹦鹉、锥尾鹦鹉、月轮、凯克、爱情鸟、吸蜜鹦鹉、亚马逊鹦鹉、灰鹦、鹰头、及巴丹等鹦鹉亦可感染，成为鹦鹉的一种重要病原。APV为多瘤病毒属(Polyomavirus)，多瘤病毒科(Polyomaviridae)成员，20面体对称，环状双股DNA。病毒在患病鹦鹉的血液、羽屑、粪便、嗉囊分泌物中均可发现，其中羽屑为最重要的散布来源。幼龄鹦鹉发病死亡率高达30％～100％。5-16周龄感染出现厌食、精神沉郁、下痢、麻痹、嗉囊排空时间延长、呕吐、皮下出血等临床症状。由于本病对鹦鹉危害极大，羽毛发育不良严重影响鹦鹉的观赏性，因此是鹦鹉需要着重预防和检疫的传染病。目前，缺乏诊断技术对鸟类多瘤病毒感染进行快速诊断，无法快速控制疫情。
技术实现思路
针对现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒及其检测方法，该试剂盒灵敏度高、特异性好、稳定性高、结果直观，其检测方法易于操作、方便快捷，能大幅缩短检测时间，为临床控制鸟类多瘤病毒感染提供有力的技术手段，尤其在鹦鹉鸟类多瘤病毒感染快速诊断方面有重要作用。为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现。(一)一种鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒，包括：裂解液、扩增反应混合液、阴性对照和阳性对照；其中，所述裂解液的成分为DNAisoReagent；所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、PCRBuffer、dNTP、APV-F上游引物、APV-R下游引物和rTaqDNA聚合酶；所述阴性对照为灭菌三蒸水；所述阳性对照为鸟类多瘤病毒阳性质粒。优选的，所述APV-F上游引物的序列为：5’-GTATGTATGACCCATAGAA-3’，所述APV-R下游引物的序列为：5’-GCAGCAGGAGAAGCCTCAGGG-3’。优选的，所述裂解液的成分为DNAisoReagent，20个反应共计20mL，装成1瓶；所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、10×PCRBuffer、2.5mmol·L-1dNTP、25μmol·L-1APV-F上游引物、25μmol·L-1APV-R下游引物和5U/μLrTaqDNA聚合酶，每个反应体积比为17.0︰2.5︰2︰0.5︰0.5︰0.5，共计23μL，20个反应共计460μL，装成1管；所述阴性对照为灭菌三蒸水，20个反应共计2.0mL，装成1瓶；所述阳性对照为鸟类多瘤病毒阳性质粒，20个反应共计40.0μL，装成1管。优选的，所述鸟类多瘤病毒为鹦鹉鸟类多瘤病毒。(二)一种鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒的检测方法，包括以下检测步骤：步骤1，DNA提取子步骤1.1，待检样品DNA提取：吸取待检样品置入无菌离心管(EP管)，加入裂解液，颠倒混匀，静置裂解，加入无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀，离心，弃去上清液，洗涤，弃去洗涤液，倒置无菌离心管，在空气中自然干燥，用NaOH溶解，得待检样品DNA提取液。子步骤1.2，阴性对照样品提取：吸取灭菌三蒸水置入无菌离心管，加入裂解液，颠倒混匀，静置裂解，加入无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀，离心，弃去上清液，洗涤，弃去洗涤液，倒置无菌离心管，在空气中自然干燥，用NaOH溶解，得阴性对照样品提取液。步骤2，PCR扩增反应子步骤2.1，待检样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液，加入所述待检样品DNA提取液，混合均匀，进行PCR扩增反应，所述PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min、94℃反应30s、54℃反应40s、72℃反应40s，共进行多个循环，最后再在72℃反应10min，得待检样品PCR扩增产物。子步骤2.2，阴性对照样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液，加入所述阴性对照样品提取液，混合均匀，进行PCR扩增反应，所述PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min、94℃反应30s、54℃反应40s、72℃反应40s，共进行多个循环，最后再在72℃反应10min，得阴性对照样品PCR扩增产物。子步骤2.3，阳性对照样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液，加入鸟类多瘤病毒阳性质粒，混合均匀，进行PCR扩增反应，所述PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min、94℃反应30s、54℃反应40s、72℃反应40s，共进行多个循环，最后在72℃反应10min，得阳性对照样品PCR扩增产物。步骤3，电泳检测通过琼脂糖凝胶电泳分别对所述待检样品PCR扩增产物、阴性对照样品PCR扩增产物和阳性对照样品PCR扩增产物进行电泳检测，并进行判断。优选的，步骤2中，所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、PCRBuffer、dNTP、APV-F上游引物、APV-R下游引物和rTaqDNA聚合酶。优选的，所述APV-F上游引物的序列为：5’-GTATGTATGACCCATAGAA-3’，所述APV-R下游引物的序列为：5’-GCAGCAGGAGAAGCCTCAGGG-3’。优选的，步骤2中，所述多个循环为35个循环。优选的，步骤3中，所述判断的标准为：阴性对照样品PCR扩增产物不出条带，阳性对照样品PCR扩增产物出306bp条带，说明对照成立；待检样品PCR扩增产物中出现306bp条带，即为鸟类多瘤病毒感染；待检样品PCR扩增产物为无条带者，即为阴性。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术所得的鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒可在短时间内确诊鹦鹉是否感染鸟类多瘤病毒，检测时间控制在2小时左右，该试剂盒的特异性好，能特异性诊断出鸟类多瘤病毒；灵敏度高，检测极限可达1.65×10-4ng·μL-1；稳定性高，试剂盒在在6个月内检测结果一致；田间试验证明试剂盒的实用性和适用性良好。其检测方法易于操作、方便快捷，能达到快速检测的目的。附图说明下面结合附图和具体实施例对本专利技术做进一步详细说明。图1为本专利技术鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒及其检测方法的特异性试验电泳图；图中M为DL2000DNA分子质量标准，1为禽痘病毒，2为鸟类多瘤病毒，3为鹦鹉喙羽病病毒，4为腺病毒，5为支原体，6为传染性喉气管炎病毒；图2为本专利技术鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒及其检测方法的灵敏度试验电泳图；图中M为DL2000DNA分子质量标准，1～8为鸟类多瘤病毒样品DNA梯度稀释，浓度范围为165×10-1ng·μL-1～165×10-8ng·μL-1；图3为本专利技术鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒对部分临床样品的电泳检测图；图中M为DL2000DNA分子质量标准，N为阴性对照，P为阳性对照，1-9为部分羽髓、羽屑、血液、血清检测结果。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域的技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限制本专利技术的范围。实施例1一种鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒，包括：裂解液、扩增反应混合液、阴性对照和阳性对照，具体如下：1)裂解液：成分为DNAisoReagent，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒，其特征在于，包括：裂解液、扩增反应混合液、阴性对照和阳性对照；其中，所述裂解液的成分为DNAiso Reagent；所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、PCR Buffer、dNTP、APV‑F上游引物、APV‑R下游引物和rTaq DNA聚合酶；所述阴性对照为灭菌三蒸水；所述阳性对照为鸟类多瘤病毒阳性质粒。

【技术特征摘要】
1.一种鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒，其特征在于，包括：裂解液、扩增反应混合液、阴性对照和阳性对照；其中，所述裂解液的成分为DNAisoReagent；所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、PCRBuffer、dNTP、APV-F上游引物、APV-R下游引物和rTaqDNA聚合酶；所述阴性对照为灭菌三蒸水；所述阳性对照为鸟类多瘤病毒阳性质粒。2.根据权利要求1所述的鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒，其特征在于，所述APV-F上游引物的序列为：5’-GTATGTATGACCCATAGAA-3’，所述APV-R下游引物的序列为：5’-GCAGCAGGAGAAGCCTCAGGG-3’。3.根据权利要求1所述的鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒，其特征在于，所述裂解液的成分为DNAisoReagent，20个反应共计20mL，装成1瓶；所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、10×PCRBuffer、2.5mmol·L-1dNTP、25μmol·L-1APV-F上游引物、25μmol·L-1APV-R下游引物和5U/μLrTaqDNA聚合酶，每个反应体积比为17.0︰2.5︰2︰0.5︰0.5︰0.5，共计23μL，20个反应共计460μL，装成1管；所述阴性对照为灭菌三蒸水，20个反应共计2.0mL，装成1瓶；所述阳性对照为鸟类多瘤病毒阳性质粒，20个反应共计40.0μL，装成1管。4.根据权利要求1所述的鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒，其特征在于，所述鸟类多瘤病毒为鹦鹉鸟类多瘤病毒。5.一种鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下检测步骤：步骤1，DNA提取子步骤1.1，待检样品DNA提取：吸取待检样品置入无菌离心管，加入裂解液，颠倒混匀，静置裂解，加入无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀，离心，弃去上清液，洗涤，弃去洗涤液，倒置无菌离心管，在空气中自然干燥，用NaOH溶解，得待检样品DNA提取液；子步骤1.2，阴性对照样品提取：吸取灭菌三蒸水置入无菌离心管，加入裂解液，颠倒混匀，静置裂解，加入无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀，离心，弃去上清液，洗涤，弃去洗涤液，倒置无菌离心管，在空气中自然干燥，用NaOH溶解，得阴性对照样品提取液；步骤2，PCR扩增反应子步骤2.1，待检样品PCR扩...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱小甫，吴旭锦，
申请(专利权)人：咸阳职业技术学院，
类型：发明
国别省市：陕西,61