应用于筛选生物被膜抑制剂的新型报告基因系统技术方案

本发明专利技术涉及一种应用于筛选生物被膜抑制剂的新型报告基因系统，本申请证明bsrA基因能够抑制铜绿假单胞菌生物被膜的形成，其编码基因在细菌中过表达，能够显著抑制生物被膜的产量。因此，以该基因为标记，构建一种新型报告基因系统，筛选能够激活标记基因表达的小分子化合物，后者能够从基因水平对生物被膜的合成进行抑制，有助于解决由生物被膜引起的持续性感染、抗生素耐药性，同时通过研究该基因抑制生物被膜形成的机制能过更好的解决食品加工行业中微生物生物膜形成机制以及生物被膜的抑制和去除问题。

A novel reporter gene system for screening biofilm inhibitors

The present invention relates to a new type of reporter gene system applied to the screening of biofilm inhibitors. The application shows that the bsrA gene can inhibit the formation of the biofilm of Pseudomonas aeruginosa, and its encoding gene is overexpressed in bacteria and can significantly inhibit the production of biofilm. Therefore, using the gene as a marker, a new type of reporter gene system is constructed to screen the small molecular compounds that can activate the expression of the labelled genes. The latter can inhibit the synthesis of the biofilm from the gene level. It is helpful to solve the persistent infection caused by the biofilm and antibiotic resistance of the biofilm. The mechanism of gene inhibition of biofilm formation can better solve the mechanism of microbial biofilm formation in the food processing industry and the inhibition and removal of biofilm.

【技术实现步骤摘要】
应用于筛选生物被膜抑制剂的新型报告基因系统
本专利技术属于生物工程领域，具体地，本专利技术涉及一种调节基因在抑制微生物的生物被膜(biofilm)中的应用。通过构建融合报告基因系统筛选一种小分子化合物激活筛选标记基因，使标记基因的表达提高，从而能够抑制生物被膜合成。对于由铜绿假单胞菌引起多重耐药性及生物被膜引发食源性疾病方面的具有重要意义。
技术介绍
目前院内感染治疗方法主要是应用抗生素杀死或者抑制病原菌的生长。但是铜绿假单胞菌自身具有一些耐药机制，包括低渗透性的外膜、不同外排泵组成型基因的表达和抗生素失活酶的产生(如头孢菌素酶)等，同时也能够获得一些抗性基因(如β-内酰胺酶的基因、编码失活氨基糖苷类抗生素的酶的基因以及修饰靶位的基因)、降低表达一些孔蛋白或者突变喹诺酮靶位基因等，所以铜绿假单胞菌对临床应用的抗生素都产生了耐药性，而且耐药程度日趋严重，多重耐药已成为当今医药界的一个世界性难题。美国传染病协会抗菌工作组(AntimicrobialAvailabilityTaskForceoftheInfectiousDiseasesSocietyofAmerica)重点考虑提高耐药菌株的治疗水平。世界卫生组织还设立了专门机构来协调各国对细菌耐药性的研究与监测。生物被膜作为一种高度组织群体，具有高度的功能性、结构性和协调性。生物被膜菌生物学特性与浮游菌具有很大的区别，较浮游菌相比生物被膜菌的耐药性明显增加，有更强的环境适应能力；因此，临床上与细菌生物被膜有关的许多感染性疾病现在都难以治愈。目前，国内外研究表明导致生物被膜菌耐药的因素很多，主要包括：①在生物被膜形成的早期，特定的细菌基因表达使得生物被膜菌耐药性较浮游菌明显增加；②生物被膜菌分泌大量胞外基质，这些基质作为屏障，降低了抗生素的渗透性，导致生物被膜菌不易被杀灭；③成熟的生物被膜生成后，自内向外菌体密度增加，形成了氧浓度和营养成分梯度，生物被膜菌的生长速度和代谢活性减慢；④表型变异的产生使生物被膜内细菌对多种抗生素产生耐药[8]。所以，生物被膜在由铜绿假单胞菌引起的持续性感染以及慢性感染中发挥重要作用，如何有效抑制生物被膜的形成对治疗铜绿假单胞菌感染起重要作用。食品安全是卫生部门十分重视的问题，由微生物引起的污染问题繁多。生物被膜的形成对工业环境具有严重的影响，一方面，生物被膜能引起一系列的工业运作问题，例如，降低热量传递、堵塞管，堵塞过滤器，并造成表面损坏。另一方面，生物被膜极易形成污染源，特别是在食品工业中，细菌附着到食物接触面，为细菌污染提供了一个及其丰富的病原体污染源，对人类健康带来不可避免的风险。对食品工业中生物被膜的微生物组成分析表明，混合生物被膜包括病原菌和腐败菌，这些微生物可以通过以下几个来源，如水、生冷类食品和动物，散布于食品工业并长时间吸附在设备表面。因此，有效的抑制生物被膜的形成对食品安全问题也起着十分重要的作用。本专利技术通过构建Tn5G转座子文库发现一株生物被膜产量增加的突变株，并通过反向PCR鉴定Tn5G插入位点，分析其突变基因，并利用互补实验证实了该基因调节生物被膜合成。通过该基因构建一种基因报告系统筛选出小分子化合物，这种小分子化合物能够激活标记基因的表达，从而能够从基因水平对生物被膜的合成阶段进行抑制，有助于解决由生物被膜引起的持续性感染、抗生素耐药性、以及由生物被膜引起的食源性感染等问题。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供能够抑制铜绿假单胞菌生物被膜合成的基因，以该基因作为筛选标记，筛选能够促进该基因表达的小分子化合物，通过该基因表达的增加从而使合成生物被膜的能力降低。本专利技术通过对生物被膜合成相关基因表达的研究，能够更好地了解bsrA与生物被膜合成相关基因相互作用的分子机制，为解决由生物被膜引起的高度耐药性提供理论依据。同时，食品工业中，微生物生物被膜引起食品污染，引发食源性疾病，通过研究该基因抑制生物被膜形成的机制能过更好的解决食品加工行业中微生物生物膜形成机制以及生物被膜的抑制和去除问题。本专利技术的技术方案为：bsrA基因作为筛选生物被膜抑制剂标记基因的应用，所述bsrA基因如序列1所示。包含bsrA基因的报告基因系统。而且，所述报告基因为LacZ基因。包含bsrA基因的报告基因系统作为筛选生物被膜抑制剂的应用。包含bsrA基因的报告基因系统作为筛选破坏或抑制生物被膜制剂的标记的应用。包含权利要求1所述基因的载体或微生物。bsrA基因作为标记生物被膜改变的应用。bsrA基因作为在检测中药和/或天然药物和/或化合物药物对生物被膜抑制剂活性标记的应用。本专利技术的优点和技术效果如下：本专利技术主要鉴定了抑制铜绿假单胞菌生物被膜合成相关基因表达的基因。通过构建菌株PAK-AR2的转座子Tn5G突变文库，获得一株生物被膜增加的突变株将其命名为P2-7，通过测其生物被膜发现，其形成生物被膜的能力显著性增加。反向PCR鉴定其突变基因为PA2121，通过生物信息学分析发现PA2121编码一DNA结合蛋白，属于LysRfamily家族调节因子。构建携带有PA2121基因的重组质粒pXJ1601，将其电转入突变株P2-7中，得到P2-7/pXJ1601。通过结晶紫染色法分析，PA2121突变后其形成生物被膜的能力增加，通过测定P2-7/pXJ1601的生物被膜发现其形成生物被膜的能力回复到野生型状态。因此得到结论突变基因PA2121抑制生物被膜的合成，将其命名为brsA(biofilmsynthesisrepressorA)。为了分析调节因子bsrA对生物被膜的调节机制。本专利技术构建了三种主要成分的四个操纵子Pel、Psl、algD、algU启动子的融合报告基因，通过接合转移的方法将携带有三种成分的融合报告基因分别转入野生型PAK-AR2、突变株P2-7中，通过测定编码β-半乳糖苷酶的活力发现，Psl、Pel、algU、algD这四种操纵子启动子的表达水平在P2-7和PAK-AR2中存在显著性差异。所以，得出结论，突变株P2-7中胞外多糖Pel、Psl、alginate的产量比野生型PAK-AR2高。同时，为了分析基因bsrA对生物被膜的抑制作用，将构建的bsrA过表达质粒导入生物被膜产量高的菌株中，分别是铜绿假单胞菌PAK、临床菌株TJ45、TJ54，发现bsrA过表达后这三株菌生物被膜的产量下降。从而验证了该基因对生物被膜的抑制作用。通过对生物被膜早晚期以及bsrA在生物被膜早期、晚期的表达情况分析发现，在早期生物被膜开始增长时，bsrA的表达水平高，当生物被膜处于较低增长水平时，bsrA的表达水平也处于较低水平。所以，通过以上实验验证并证明了bsrA抑制生物被膜的形成及其调节机制。鉴于该基因的抑制作用，本申请以该基作为筛选标记构建新型报告基因系统，筛选小分子化合物通过促进或激活该标记基因的表达来抑制生物被膜的形成。本专利技术涉及一种铜绿假单胞菌基因功能及其应用，铜绿假单胞菌的基因bsrA是生物被膜合成过程的调节基因，该转录调节因子能够抑制生物被膜的合成，可用于合成促进该基因表达的药物，从而抑制生物被膜合成而降低抗生素耐药性的应用。本专利技术通过对生物被膜合成相关基因表达的研究，能够更好地理解bsrA与生物被膜合成相关基因相互作用的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.bsrA基因作为筛选生物被膜抑制剂标记基因的应用，所述bsrA基因如序列1所示。

【技术特征摘要】
1.bsrA基因作为筛选生物被膜抑制剂标记基因的应用，所述bsrA基因如序列1所示。2.包含bsrA基因的报告基因系统。3.根据权利要2所述的包含bsrA基因的报告基因系统，其特征在于：所述报告基因为LacZ基因。4.根据权利要3所述的包含bsrA基因的报告基因系统，其特征在于：所述bsrA基因与LacZ基因经过EcoRI酶和BamHI酶切后连接。5.权利要求2或3所述的包含bsrA基因的报告基因系统作...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨洪江，杨肖静，黄志伟，张茜茜，龚梦馨，张志强，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津,12