PARP1抑制剂在制备逆转肿瘤细胞对氨甲蝶呤耐药性药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了PARP1抑制剂在制备逆转肿瘤细胞对氨甲蝶呤耐药性药物中的应用，属于肿瘤生物治疗技术领域。本发明专利技术发明专利技术人通过研究发现针对MTX耐药且DHFR基因高度扩增的恶性肿瘤细胞，特异性地抑制A‑NHEJ通路的关键蛋白PARP1，能够降低DHFR基因拷贝数、减少细胞内的DMs，从而逆转肿瘤耐药，提高肿瘤治疗的效率。因此，在上述研究的基础上本发明专利技术提出了PARP1抑制剂在制备通过降低DHFR基因拷贝数从而逆转肿瘤细胞对MTX耐药性的药物中的应用。本发明专利技术的提出为MTX作为主要治疗药物且易产生耐药性的恶性肿瘤的生物治疗提供新的靶向性治疗方案，为有效地对抗MTX耐药提供了科学的依据。此外，本发明专利技术对于深入了解化疗耐药的本质以及寻找个体化治疗的耐药靶点也具有非常积极的意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及PARP1抑制剂通过降低肿瘤细胞中DHFR基因拷贝数进而逆转肿瘤细胞对MTX耐药性的方法，为揭示新的治疗靶点、更加有效地对抗MTX耐药提供科学的依据，属于肿瘤生物治疗

技术介绍
氨甲蝶呤(Methotrexate，MTX)是一种抗叶酸类抗肿瘤药物，能竞争性结合二氢叶酸还原酶(Dihydrofolatereductase，DHFR)抑制核苷酸代谢，从而阻断DNA的合成，特异性地杀伤增殖期细胞。但是，在肿瘤治疗过程中，长时间持续给药会使肿瘤细胞获得耐药性，使治疗效果不佳。DHFR基因扩增，酶水平升高，是导致MTX耐药的重要机制。基因扩增是指细胞内基因组某一特定区域拷贝数大量增加的现象，是激活细胞癌基因使肿瘤细胞获得无限生长的重要途径。文献报道，基因扩增与肿瘤耐药密切相关：慢性髓细胞性白血病中Bcr-Abl融合基因的扩增可产生伊马替尼抗性；多发性骨髓瘤中PDZK1基因的扩增可产生顺铂耐药等。双微体(doubleminutes，DMs)是1962年首次在结肠癌细胞中发现的成对环状、无着丝粒、能自主复制的染色小体，是基因扩增的主要细胞遗传学表现形式，其上常携带耐药基因。DMs形成机制十分复杂，常伴随染色体的断裂重排，与DNA双链断裂(doublestrandbreaks，DSBs)的产生和错误修复有关。因此，及时正确地修复DSBs可能是减少DMs形成进而防止基因扩增发生的有效途径。哺乳动物细胞中，修复DSBs的方式主要有两种：同源重组(homologousrecombination，HR)修复和非同源末端连接(non-homologousendjoining，NHEJ)修复。其中，NHEJ又分为经典的非同源末端连接(classicalnon-homologousendjoining，C-NHEJ)和选择性非同源末端连接(alternativenon-homologousendjoining，A-NHEJ)。A-NHEJ是一种依赖微同源的，较C-NHEJ慢得多的修复方式，A-NHEJ可以增加多个DSBs共存在的机会。另外，A-NHEJ修复过程经常产生大的基因组缺失、微同源和大的未知起源的DNA片段插入，是一种保真性更差、更倾向于产生基因组重排、染色体结构异常。A-NHEJ途径的主要蛋白包括：PARP1(Poly[ADP-ribose]polymerase1)、LIG3、XRCC1、剪切酶复合体(MRE11/RAD50/NBS1)等，其中PARP1发挥着核心作用。PARP1能与Ku蛋白竞争性识别绑定DSBs末端，并募集下游MRN复合体和LIG3/XRCC1对DSBs末端进行剪切和连接，完成A-NHEJ修复。文献报道，PARP1在恶性淋巴瘤、大肠癌、肝癌等多种肿瘤细胞中呈现高表达，因此，A-NHEJ修复功能增强，增加了基因组不稳定的几率。本专利技术专利技术人在前期的研究中发现，在高浓度MTX耐药细胞中，随着DMs的出现，PARP1表达增加，猜测PARP1可能促进DMs形成，使DHFR基因拷贝数增加进而使肿瘤细胞耐药性增强。因此，本专利技术专利技术人在含DMs的HT29MTX耐药细胞中稳定干扰PARP1，结果观察到干扰PARP1可以通过去除DMs降低DHFR基因拷贝数，逆转肿瘤耐药表型，为肿瘤治疗提供新的靶点，为有效地对抗MTX耐药提供科学依据。
技术实现思路
针对肿瘤治疗药物MTX在治疗过程中常产生耐药而导致化疗失败甚至疾病复发的现象，本专利技术的目的在于提供PARP1抑制剂通过下调DHFR基因拷贝数进而逆转肿瘤细胞对MTX耐药性的新的生物治疗策略，从而为揭示新的治疗靶点、更加有效地对抗MTX耐药提供科学的依据。为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：本专利技术的技术方案是检测HT29及含DMs的HT29MTX耐药细胞(HT2910-4mol/LMTX)中，A-NHEJ通路关键蛋白的表达差异。然后，将阴性对照和干扰PARP1的慢病毒载体分别转入含DMs的HT29MTX耐药细胞中，获得稳定转染克隆。应用WesternBlot、免疫荧光、Real-timePCR、FISH、MTT等方法，检测转染PARP1前后细胞的DSBs形成及修复、基因拷贝数、含DHFR基因的DMs数目、微核/核出芽外排、细胞生长、凋亡、自噬、耐药的变化情况。同时，FISH分析PARP1抑制剂ABT-888短期作用含DMs的HT29MTX耐药细胞，含DHFR基因的DMs数目变化情况。通过以上实验，明确干扰PARP1抑制A-NHEJ功能是否可以通过去除DMs降低DHFR基因拷贝数，达到逆转耐药的肿瘤作用。从而为揭示新的治疗靶点，更加有效对抗MTX耐药提供科学依据。1.A-NHEJ相关蛋白的表达分析提取细胞总蛋白，应用WesternBlot方法检测PARP1、LIG3和XRCC1在HT29及含DMs的HT29MTX耐药细胞中的表达情况。2.含DMs的HT29MTX耐药细胞中稳定干扰PARP1克隆的建立确定含DMs的HT29MTX耐药细胞对嘌呤霉素的敏感性，选择适当的嘌呤霉素浓度作为稳定转染时的药物筛选浓度。将细胞以7×104个/孔的密度接种于24孔培养板中，培养24小时待细胞贴壁后，进行转染。细胞转染分两组进行：第一组转染阴性对照病毒；第二组转染PARP1干扰病毒。混匀后继续培养，8～12小时以后观察细胞形态，更换为新鲜培养基。培养24h后，加入0.3μg/ml的嘌呤霉素。在培养过程中，大部分细胞皱缩死亡，只有少数细胞存活，换液，继续培养。最后，存活细胞开始增殖并逐渐形成单克隆。当形成的克隆达到肉眼可见大小的时候，进行克隆挑取。含DMs的HT29MTX耐药细胞对照组克隆命名为sh-control，干扰组克隆命名为sh-PARP1。3.检测PARP1蛋白质表达情况鉴定稳定干扰克隆的干扰效果提取细胞总蛋白，应用WesternBlot方法检测PARP1蛋白在sh-control和sh-PARP1克隆中的表达情况。4.含DMs的HT29MTX耐药细胞稳定干扰PARP1对DSBs产生及修复的影响(1)应用WesternBlot和免疫荧光方法检测sh-control和sh-PARP1克隆中γ-H2AX的表达及灶点数变化。(2)应用WesternBlot方法检测sh-control和sh-PARP1克隆中C-NHEJ通路关键蛋白DNA-PKcs、Ku70、Ku86、Ligase4、XRCC4和Artemis的表达情况。(3)应用WesternBlot方法检测sh-control和sh-PARP1克隆中HR通路关键蛋白BRCA1、MRE11、RAD50和NBS1的表达情况。5.含DMs的HT29MTX耐药细胞稳定干扰PARP1对DHFR基因拷贝数及蛋白表达情况的影响(1)以sh-control和sh-PARP1克隆的DNA为模板，应用Real-timePCR技术分析干扰PARP1对DHFR基因拷贝数的影响。β-ACTIN作为内参对照基因。(2)提取细胞总蛋白，应用WesternBlot方法检测sh-control和sh-PARP1克隆中DHFR蛋白表达情况。6.含DMs的HT29MTX耐药细胞稳定干扰PARP1对DHFR基因扩增形式及同一扩增子上本文档来自技高网...

【技术保护点】
PARP1抑制剂在制备逆转肿瘤细胞对氨甲蝶呤(MTX)耐药性药物中的应用。

【技术特征摘要】
1.PARP1抑制剂在制备逆转肿瘤细胞对氨甲蝶呤(MTX)耐药性药物中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的PARP1抑制剂为ABT-888(2-[(2R)-2-甲基-2-吡咯烷基]-1H-苯并咪唑-7-甲酰胺)或干扰PARP1的慢病毒载体。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的干扰PARP1的慢病毒载体为PIEL248074090，购自上海吉凯基因公司。4.如权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟祥宁，侯丽青，高巍，关荣伟，刘鹏，冀国华，马金法，宋盈，
申请(专利权)人：哈尔滨医科大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23