本发明专利技术提供血浆中乙酰胆碱的浓度检测方法的UPLC‑MS/MS检测方法，包括以下步骤：（1）血浆样品预处理方法：取人空白血浆，加入胆碱酯酶抑制剂，涡旋混匀后，4℃冰箱中放置20min，加入5ul std溶液，涡旋混匀后，再加入CH3OH:CH3CN=1:1的溶液沉淀蛋白，涡旋1min后，离心,取上清进样测定；（2）按照一定条件进行UPLC‑MS/MS检测；(3）制作标准曲线：选取乙酰胆碱浓度为2ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，200ng/ml按照以上方法处理后，其数据制备标准曲线;(4）根据样品的峰面积和标准曲线的回归方程中，计算尿血浆中乙酰胆碱的浓度。本发明专利技术的有益效果是简单快捷，灵敏度高，抗干扰能力强，适合多种情况下乙酰胆碱的定性定量检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物分析领域，尤其是涉及一种血浆中乙酰胆碱的浓度的UPLC-MS/MS检测方法。
技术介绍
神经递质是一种在神经系统中担当信使的特定的化学物质，在生命活动中起着非常重要的调控作用。乙酰胆碱是一种胆碱类的神经递质，对反应的警戒性，大脑的记忆力，以及学习能力都会产生影响。对乙酰胆碱的测定多采用电化学检测法，但其步骤十分繁杂。因此，在实际复杂的样品以及医学临床诊断中需要发展一种高专属性、简单、快速、灵敏的检测方法。自从色谱-质谱联用技术发展以来，人们利用该技术在化学物质定性定量分析、临床医药检测、以及生物大分子如蛋白质、核酸、糖类等方面进行了广泛和深入的研究。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种操作简单、检测效率高、成本低的血浆中乙酰胆碱的浓度检测方法。本专利技术公开了利用液质联用技术建立了血浆中乙酰胆碱一种新的检测技术方法，并为医学研究及临床诊断提供准确、快速、灵敏的分析方法。本专利技术的技术方案是：血浆中乙酰胆碱的浓度检测方法的UPLC-MS/MS检测方法，包括以下步骤：1)血浆样品预处理方法：取人空白血浆，加入胆碱酯酶抑制剂，涡旋混匀后，4℃冰箱中放置20min，使胆碱酯酶抑制剂与乙酰胆碱酯酶充分作用，然后再加入5ulstd溶液，涡旋混匀后，再加入CH3OH:CH3CN＝1:1的溶液沉淀蛋白，涡旋1min后，15000r/min离心10min,取上清150ul进样测定。2)样品HPLC-MS/MS检测条件为：液相条件流动相：A:0.1％甲酸水溶液B:0.1％甲酸的乙腈溶液流速：0.5ml/min进样量：5ul色谱柱：安捷伦ZORBAXSB-Aq4.6*150mm,5um梯度洗脱程序Time/minA％B％09553.59555.077235.195510.0955质谱条件毛细管电压(kV):3.2kV源温度(℃):120脱溶剂气温度(℃):300脱溶剂气流量(L/Hr)600气帘气流量(L/Hr):50；驻留时间(s):0.023)制作标准曲线：选取乙酰胆碱浓度为2ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，200ng/ml按照以上方法处理后，进样检测，其数据制备标准曲线。4)根据样品的峰面积和标准曲线的回归方程中，计算血浆中乙酰胆碱的浓度进一步，所述胆碱酯酶抑制剂为小檗碱。进一步，小檗碱作为乙酰胆碱酯酶抑制剂的浓度为0.5mg/ml。处理方法为：取人空白血浆50ul，加入5ul5mg/ml小檗碱溶液(即小檗碱在血浆的终浓度为0.5mg/ml)，涡旋混匀后，4℃冰箱中放置20min,使小檗碱与乙酰胆碱酯酶充分作用，然后再加入5ulstd溶液，涡旋混匀后，再加入150ulCH3OH:CH3CN＝1:1的溶液沉淀蛋白，涡旋1min后，15000r/min离心10min,取上清150ul进样测定。进一步，乙酰胆碱的保留时间为3.43min。进一步，用小檗碱抑制乙酰胆碱酯酶后在测定血浆中乙酰胆碱，最低检测限为0.5ng/ml。进一步，该检测方法中，定量限为2ng/ml，线性范围为2-200ng/ml。进一步，所述胆碱酯酶抑制剂为石杉碱甲或毒扁豆碱。血浆中的乙酰胆碱酯酶会快速将乙酰胆碱水解，因此难检测到血浆中的Ach，以此为依据，在血浆中加入乙酰胆碱酯酶抑制剂，抑制乙酰胆碱的快速水解。本专利技术具有的优点和积极效果是：UPLC-MS/MS检测方法检测血浆中乙酰胆碱浓度，简单快捷，灵敏度高，抗干扰能力强，适合多种情况下乙酰胆碱的定性定量检测，为生物检测行业中血浆中乙酰胆碱的检测提供了指导方法。附图说明图1是血浆中小檗碱浓度依次为0.01、0.1、0.5、1mg/ml时，Ach为50ng/ml的色谱图。图2是为空白血浆色谱图，在保留时间为3.24min和3.64min处有两个干扰色谱峰。图3是加0.5mg/ml小檗碱后血浆中Ach浓度依次为1，5，50，100ng/ml时的色谱图。图4是乙酰胆碱制备得到的标准曲线。具体实施方式实施例1不同浓度小檗碱试验：取人空白血浆50ul，加入不同浓度的小檗碱溶液(即小檗碱在血浆的终浓度分别为0.01、0.1、0.5、1mg/ml)，涡旋混匀后，4℃冰箱中放置20min,使小檗碱与乙酰胆碱酯酶充分作用，然后再加入5ulstd溶液，涡旋混匀后，再加入150ulCH3OH:CH3CN＝1:1的溶液沉淀蛋白，涡旋1min后，15000r/min离心10min,取上清150ul进样测定。图1为血浆中小檗碱浓度依次为0.01、0.1、0.5、1mg/ml时，血浆中Ach为50ng/ml的色谱图，有图可见，但血浆中小檗碱浓度为0.5mg/ml和1mg/ml时，保留时间为3.44min处的Ach色谱峰强度基本相当，而血浆中小檗碱浓度为0.1mg/ml和0.01mg/ml时，保留时间为3.44min处的Ach色谱峰强度依次减弱。因此血浆中0.5mg/ml的小檗碱即可对血浆中乙酰胆碱酯酶达到完全抑制，故后续试验中选择0.5mg/ml的小檗碱作为乙酰胆碱酯酶抑制剂。实施例2最低检出限实验：分别取含1ng/ml、5ng/ml、50ng/ml和100ng/ml血浆50ul和50ul空白血浆，加入小檗碱溶液使小檗碱在血浆的终浓度为0.5mg/ml，涡旋混匀后，4℃冰箱中放置20min,使小檗碱与乙酰胆碱酯酶充分作用，然后再加入5ulstd溶液，涡旋混匀后，4℃冰箱中放置20min。再加入150ulCH3OH:CH3CN＝1:1的溶液沉淀蛋白，涡旋1min后，15000r/min离心10min,取上清150ul进样测定。图2为空白血浆色谱图，在保留时间为3.24min和3.64min处有两个干扰色谱峰。图3与图2比，Ach浓度为50ng/ml和100ng/ml时，保留时间在3.43处的Ach色谱峰明显，Ach浓度为1ng/ml时，Ach的色谱峰不明显，5ng/ml可见明显Ach峰，信噪比为20。检测限为0.5ng/ml。所以用小檗碱抑制乙酰胆碱酯酶后在测定血浆中乙酰胆碱的方法，最低定量限在2ng/ml。实施例3标准曲线的制备：选取乙酰胆碱浓度为2ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，200ng/ml，加入小檗碱溶液使小檗碱在血浆的终浓度为0.5mg/ml，涡旋混匀后，4℃冰箱中放置20min,使小檗碱与乙酰胆碱酯酶充分作用，然后再加入5ulstd溶液，涡旋混匀后，再加入150ulCH3OH:CH3CN＝1:1的溶液沉淀蛋白，涡旋1min后，15000r/min离心10min,取上清150ul进样测定。图4为制备得到的标准曲线。实施例4回收率与基质效应试验：选取乙酰胆碱浓度为2ng/ml，50ng/ml，1600ng/ml，加入小檗碱溶液使小檗碱在血浆的终浓度为0.5mg/ml，涡旋混匀后，4℃冰箱中放置20min,使小檗碱与乙酰胆碱酯酶充分作用，然后再加入5ulstd溶液，涡旋混匀后，再加入150ulCH3OH:CH3CN＝1:1的溶液沉淀蛋白，涡旋1min后，15000r/min离心10min,取上清15本文档来自技高网...
【技术保护点】
血浆中乙酰胆碱的浓度检测方法的UPLC‑MS/MS检测方法，其特征在于：包括以下步骤：1)血浆样品预处理方法：取人空白血浆，加入胆碱酯酶抑制剂，涡旋混匀后，4℃冰箱中放置20min，使胆碱酯酶抑制剂与乙酰胆碱酯酶充分作用，然后再加入5ul std溶液，涡旋混匀后，再加入CH3OH:CH3CN＝1:1的溶液沉淀蛋白，涡旋1min后，15000r/min离心10min,取上清150ul进样测定；2)样品HPLC‑MS/MS检测条件为：液相条件流动相：A:0.1％甲酸水溶液 B:0.1％甲酸的乙腈溶液流速：0.5ml/min 进样量：5ul色谱柱：安捷伦ZORBAX SB‑Aq 4.6*150mm,5um梯度洗脱程序Time/minA％B％09553.59555.077235.195510.0955质谱条件毛细管电压(kV):3.2kV 源温度(℃):120脱溶剂气温度(℃):300 脱溶剂气流量(L/Hr)600气帘气流量(L/Hr):50； 驻留时间(s):0.023)制作标准曲线：选取乙酰胆碱浓度为2ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，200ng/ml按照以上方法处理后，进样检测，其数据制备标准曲线；4)根据样品的峰面积和标准曲线的回归方程中，计算血浆中乙酰胆碱的浓度。...
【技术特征摘要】
1.血浆中乙酰胆碱的浓度检测方法的UPLC-MS/MS检测方法，其特征在于：包括以下步骤：1)血浆样品预处理方法：取人空白血浆，加入胆碱酯酶抑制剂，涡旋混匀后，4℃冰箱中放置20min，使胆碱酯酶抑制剂与乙酰胆碱酯酶充分作用，然后再加入5ulstd溶液，涡旋混匀后，再加入CH3OH:CH3CN＝1:1的溶液沉淀蛋白，涡旋1min后，15000r/min离心10min,取上清150ul进样测定；2)样品HPLC-MS/MS检测条件为：液相条件流动相：A:0.1％甲酸水溶液B:0.1％甲酸的乙腈溶液流速：0.5ml/min进样量：5ul色谱柱：安捷伦ZORBAXSB-Aq4.6*150mm,5um梯度洗脱程序Time/minA％B％09553.59555.077235.195510.0955质谱条件毛细管电压(kV):3.2kV源温度(℃):120脱溶剂气温度(℃):300脱溶剂气流量(L/Hr)600气帘气流量(L/Hr):50；驻留时间(s):0.023)制作标准曲线：选取乙酰胆碱浓度为2ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，200ng/ml按照以上方法处理后，进样检测，其数据制备标准曲线；4)根据样品的峰面积和标准曲线的回归方程中，计算血浆中乙酰胆碱的浓度。2.根据权利要求1所述的血浆中乙酰胆碱的浓度检测方法的UPLC-MS/MS检测方法，其特征在于：步骤(1)所述乙酰胆碱酯酶抑制...
【专利技术属性】
技术研发人员：付淑军，冯利民，袁圆，赖东海，
申请(专利权)人：瀚盟测试科技天津有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12
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