The invention provides the nested PCR specific primers of the SGLT2mRNA shear mutant, and the amplification of the SGLT2mRNA shear body from the peripheral blood leukocytes by the specific primers, thus realizing the method of specific detection of the deletion of exon SGLT2mRNA 8 from the peripheral blood white blood cells with very low expression. The method included the following steps: (1) separation and collection of peripheral blood mononuclear cells; (2) total RNA extraction and reverse transcriptase; (3) PCR amplification of exon SGLT2 8: (4) the third wheel PCR product was identified by electrophoresis; (5) the third round product was sequenced; (6) the mutation detection results of SGLT2mRNA 8 exon shear were obtained. . The invention realizes a simple, rapid and accurate detection of a shear mutant of SGLT2mRNA.
【技术实现步骤摘要】
SGLT2mRNA的剪切突变体的巢式PCR特异性引物及应用
本专利技术属于生物学
，具体涉及一种SGLT2mRNA的剪切突变体的巢式PCR特异性引物，以及采用所述特异性引物从表达量极低的外周血白细胞中特异性检测SGLT2mRNA8号外显子缺失的方法。
技术介绍
钠-葡萄糖协同转运蛋白2(SGLT2)是肾近端小管重吸收葡萄糖的关键，负责重吸收约90％由肾小球滤过的葡萄糖。SGLT2蛋白由SLC5A2基因编码。SLC5A2基因突变导致家族性肾性糖尿，该病诊断主要依据临床表现和实验室检查。标准如下：(1)24h尿葡萄糖＞0.3g.(1.73m2)-1.d-1；(2)葡萄糖代谢正常；(3)无其他肾脏病证据，包括无血尿、蛋白尿、氨基酸尿或磷酸盐尿等，肾功能正常；(4)孕妇除外。其中，24h尿糖<10g/1.73m2定义为轻度糖尿；20g/1.73m2＞24h尿糖≥10g/1.73m2为中度糖尿；24尿糖≥20g/1.73m2为重度糖尿。SLC5A2基因突变分析是研究家族性肾性糖尿患者基因型与表型关系的必要手段。目前，SLC5A2基因突变主要通过提取病人外...
【技术保护点】
1.SGLT2mRNA的剪切突变体的巢式PCR特异性引物，其特征在于：包括三对特异性引物，具体为：引物1序列：5'TTCACCAAGATCTCAGTGGA 3'；引物2序列：5'CCTGGGGCTCATTCATCT 3'；引物3序列：5'GGGCATCACCATGATTTACAC3'；引物4序列：5'TCCTCCCGTTCCTCCTTG3'；引物5序列：5'ATGGGTTACGCCTTCCACGAG3'；引物6序列：5'CAGACCGTTGGGCATGAGCT3'。
【技术特征摘要】
1.SGLT2mRNA的剪切突变体的巢式PCR特异性引物，其特征在于：包括三对特异性引物，具体为：引物1序列：5'TTCACCAAGATCTCAGTGGA3'；引物2序列：5'CCTGGGGCTCATTCATCT3'；引物3序列：5'GGGCATCACCATGATTTACAC3'；引物4序列：5'TCCTCCCGTTCCTCCTTG3'；引物5序列：5'ATGGGTTACGCCTTCCACGAG3'；引物6序列：5'CAGACCGTTGGGCATGAGCT3'。2.采用如权利要求1所述引物从外周血白细胞中检测SGLT2mRNA的剪切突变体的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)外周血单个核细胞分离收集；(2)总RNA提取及逆转录反应，得到外周血白细胞cDNA；(3)SGLT28号外显子的PCR扩增：I.以外周血白细胞cDNA为模板，以权利要求1所述的引物1+引物2为第一套引物，加入2×PCRmix和灭菌水，混合，进行第一轮PCR；II.以第一轮PCR产物DNA为模板，以权利要求1所述的引物3+引物4为第二套引物，加入加入2×PCRmix和灭菌水，在冰上混合，进行第二轮PCR；III.以第二轮PCR产物DNA为模板，以权利要求1所述的引物5+引物6为第三套引物，加入加入2×PCRmix和灭菌水，在冰上混合，进行第三轮PCR；(4)取第三轮PCR产物进行电泳鉴定；(5)取第三轮产物进行序列测定；(6)根据步骤(4)电泳条带大小和步骤(5)的测序结果，得到SGLT2mRNA8号外显子剪切的突变检测结果。3.根据权利要求2所述的从外周血白细胞中检测SGLT2mRNA的剪切突变体的方法，其特征在于：步骤(3)第一轮PCR反应条件为：95℃5min；95℃30sec，63℃30sec，72℃1min，3个循环；95℃30sec，60℃30sec，72℃1min，3个循环；95℃30sec，58℃30sec，72℃1min，4个循环；95℃30sec，55℃30sec，72℃1min，4个循环；95℃30sec，53℃30sec，72℃1min，3个...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵向忠，邵乐平，崔莉，姚如永，隋爱华，刘家秀，
申请(专利权)人：青岛大学附属医院，
类型：发明
国别省市：山东,37
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