本发明专利技术公开了一种麦冬多糖和白术多糖组合物及其制备方法，并公开了上述麦冬多糖和白术多糖组合物在促进人脐带间充质干细胞体外增殖的应用。本发明专利技术所述药物组合可以使间充质干细胞保持较高活性，增殖速度大幅度提高，并且防止其分化。应用本发明专利技术制备的脐带间充质干细胞对科学研究与临床应用具有重要意义。
A polysaccharide composition promoting the proliferation of human umbilical cord mesenchymal stem cells and its application
The invention discloses a polysaccharide composition of Ophiopogon japonicus and the preparation method of the polysaccharide of Atractylodes macrocephala and the application of the polysaccharide composition and the polysaccharide composition of the Atractylodes macrocephala in promoting the proliferation of human umbilical cord mesenchymal stem cells in vitro. The drug combination can maintain the high activity of mesenchymal stem cells, greatly increase the proliferation rate and prevent differentiation. The umbilical cord mesenchymal stem cells prepared by the invention are of great significance for scientific research and clinical application.
【技术实现步骤摘要】
一种促进人脐带间充质干细胞增殖的多糖组合物及其应用
本专利技术属于生物医药
，涉及一种多糖组合物的制备与用途，具体涉及麦冬多糖与白术多糖组合物在促进人脐带间充质干细胞增殖方面的用途。
技术介绍
人脐带间充质干细胞（MesenchymalStemCells，MSCs）是指存在于新生儿脐带组织中的一种具有全能干细胞特点的细胞，是中胚层发育的早期细胞，可向中胚层和外胚层来源的组织分化，具有多向分化潜能，其形态和生物学特点与骨髓源性MSCs相似（BrJHaematology,2000,109:235-242）。脐带间充质干细胞（MSCs）具有较高的分化潜能，在一定的实验条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、肝细胞、骨骼肌细胞等(Blood,2004,103:1669-1675)。从人脐带中分离出MSCs，其细胞含量、扩增能力优于骨髓MSCs，免疫原性比骨髓MSCs低，并且具有取材方便，无伦理学争议等优点，可作为一种新的替代细胞来源，用于各系统疾病的细胞移植及基因治疗。麦冬为百合科沿阶草属植物麦冬的干燥块根、具有养阴生津、润肺清心之功效（中国药典.2015:155-156）。麦冬主要含甾体皂苷、高异黄酮、多糖等活性成分。麦冬中含有大量的多糖类成分，并由单糖与低聚糖类化合物组成。文献报道，麦冬多糖经水解之后主要由果糖组成，其果糖与葡萄糖的比例为35∶1（中草药，2005，36(5):1488）。现代药理研究表明麦冬多糖具有广泛的药理作用，包括降糖作用、抗心肌缺血和心肌梗塞作用、对肌体免疫系统的作用、抗氧化作用、抗肿瘤作用、外分泌腺保护作用等。麦冬多糖含量较高，提取工艺相对简单。白术为菊科植物白术的干燥根茎，性温，味甘苦，具有健脾、益气等作用。白术多糖(PAM)是白术的主要活性成分，主要是由葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖组成的杂多糖，具有调节免疫、抗氧化及抗衰老、抗肿瘤、降血糖等作用（中药材，2006:107–109）。目前人脐带间充质干细胞已广泛应用于各种基础研究及疾病治疗的临床实验，但目前所使用的培养方案各异，培养效果并不稳定，常出现干细胞生长速度慢、形态改变导致性状改变、细胞活率降低等问题。本专利技术的目的是提供一种能促进人脐带间充质干细胞增殖的多糖组合物，用于获得稳定可靠的人脐带间充质干细胞。
技术实现思路
专利技术人在实验中发现，麦冬多糖与白术多糖组合物在合适配比和浓度下对人脐带间充质干细胞具有促进增值作用，促进体外培养的脐带间充质干细胞的增殖能力，增强细胞活性。本专利技术提供的多糖组合物可以作为人脐带间充质干细胞增殖促进剂以及用于制备促进人脐带间充质干细胞增殖的药物，也可为人脐带间充质干细胞增殖机理的研究提供大量干细胞。本专利技术首先是提供一种麦冬多糖与白术多糖组合物的制备方法，该制备方法工艺简单，提取效率高。该技术方案以麦冬多糖与白术多糖为原料，经水提取和乙醇处理后制备获得。在上述制备方法中：本专利技术所述麦冬与白术的重量份配比为300-100:100；佳选为300:100。本专利技术水提取时，每次提取时水的用量为原料总重量的5-20倍，提取2-3次，每次提取时间为1-2h。本专利技术水提取后，过滤后将滤液浓缩，所得浓缩液采用体积百分含量为60-95%的乙醇水溶液进行醇沉处理，获得沉淀物即为麦冬多糖与白术多糖组合物。其中浓缩优选冷冻真空浓缩。本专利技术所述的多糖组合物包括麦冬多糖与白术多糖。按照前述方法提取出麦冬多糖与白术多糖，其优选组合比例为3∶1。本专利技术第二个目的是提供上述麦冬多糖与白术多糖组合物在作为促进人脐带间充质干细胞增殖中的应用。按照1％的比例将麦冬多糖与白术多糖加入到基础培养基中。基础培养基包括DMEM/F12，1640，α-MEM等。检测干细胞增殖情况采用MTT法测试细胞活性，细胞活性采用下列公式：本专利技术的相关实验数据证明，使用本专利技术多糖组合可对人脐带间充质干细胞的增殖培养起到促进作用。通过显微镜观察，使用本专利技术所述药物组合可以使间充质干细胞保持较高活性，增殖速度大幅度提高，并且防止其分化。本专利技术对脐带间充质干细胞的科学研究与临床应用具有重要意义。本专利技术的有益效果：1、本专利技术在基础培养基中加入麦冬多糖与白术多糖培养人脐带间充质干细胞，该干细胞的活性及形态均能长期保持，有效保持了干细胞自身的分化能力，保证了干细胞的质量。2、采用本专利技术的培养基培养的干细胞，其增值能力显著高于基础培养基培养的干细胞，有效增加人脐带间充质干细胞生长速度。3、本专利技术的效果显著，极其适合人脐带间充质干细胞的培养，适于推广。附图说明图1实施例3脐带间充质干细胞增殖情况。图2实施例4脐带间充质干细胞增殖情况。图3实施例5脐带间充质干细胞增殖情况。具体实施方式下面结合具体的实施例和说明书附图，更具体说明本专利技术的内容。应当理解，这些实施例仅用于说明本专利技术，而本专利技术并不局限于下面的实施例。本专利技术使用的试剂及仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。若无特别指明，实施例采用的方法为本领域通用技术；若无特别注明条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》（第四版）（GreenM.R,SambrookJ.著；贺福初等译，科学出版社，2017）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1人脐带间充质干细胞分离和纯化:无菌条件下将人脐带用PBS缓冲液（含青霉素、链霉素）冲洗3次，剔除脐带外膜及血管，剪碎后按1：3的体积比与含有胰酶(w/v为0.05％)和Ⅳ型胶原酶(1.5mg/mL)的低糖DMEM(Gibco)混合液混合，37℃下消化1h，200目滤网过滤未消化的组织块，再加入终浓度为25ug/mL的透明质酸酶消化10min，100-200r/min下离心10min，弃上清，用含10％FBS的低糖DMEM培养基清洗沉淀1次，于100-200r/min下离心10min，去除上清液得到沉淀即为原代脐带间充质干细胞；将所得原代脐带间充质干细胞接种于培养基中，于37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养，每隔3-4天换一次培养基。待细胞融合度为70-80％时，用含有EDTA的胰酶溶液消化传代。MSC培养至P3代，用显微镜拍照记录细胞形态，并用于后续实验。实施例2麦冬多糖与白术多糖组合物及其制备方法:取干燥的麦冬药材300g与白术药材100g粉碎混匀，加入4000ml纯净水，煮沸2h；再次加入2000ml纯净水，煮沸1h；过滤去除杂质，滤液真空浓缩，浓缩液用体积百分比浓度为70%的乙醇水溶液醇沉，离心获得沉淀物即为麦冬多糖与白术多糖组合物。实施例3麦冬多糖与白术多糖组合物对脐带间充质干细胞增殖的促进作用:将麦冬多糖与白术多糖组合物(实施例2获得或购买麦冬多糖与白术多糖单体按照3∶1的比例混合后过滤灭菌），按1％比例溶于DMEM/F12培养基中。用该培养基培养脐带间充质干细胞(间充质干细胞按实施例1方法从脐带中获得)。实验分组为：培养基对照组(不加多糖组合物)；培养基+多糖组合物。培养四天后加入无血清DMEM/F12培养基洗两遍后用MTT以5mg/mL的终浓度处理，并于37℃孵育约4小时后小心吸取上清，加100μL的DMSO进入24孔板中溶解紫色沉淀，并在室温下于摇床上摇10分钟，让结晶物充分溶解；待紫色沉淀完全溶解后在全自动酶标仪上检测O本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种具有促进间充质干细胞增殖作用的多糖组合物，其特征在于：所述多糖组合物由麦冬多糖和白术多糖组成。
【技术特征摘要】
1.一种具有促进间充质干细胞增殖作用的多糖组合物，其特征在于：所述多糖组合物由麦冬多糖和白术多糖组成。2.根据权利要求1所述的麦冬多糖与白术多糖组合物以干燥麦冬与白术为原料，经水提和乙醇处理后制备获得。3.根据权利要求2所述制备的麦冬多糖与白术多糖组合物，其特征在于：所述麦冬与白术的重量份配比为300-100:100；水提取时，每次提取时水的用量为原料总重量的5-20倍，提取2-3次，每次提取时间为1-2h；水提取后，过滤后将滤液浓缩，所得浓缩液采用体积百分含量为60～95%的乙醇水溶液进行...
【专利技术属性】
技术研发人员：向双林，黄招琴，彭海宁，杨满君，颜峰，胡翔，
申请(专利权)人：南华生物医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43
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