一种间充质干细胞无血清培养基及培养方法技术

本发明专利技术公开了一种间充质干细胞无血清培养基及培养方法，无血清培养基包括基础培养基和添加成分，所述的添加成分包括低氧诱导因子‑1，所述的低氧诱导因子‑1的浓度为10‑20ng/ml；还包括力生长因子，所述的力生长因子的浓度为20‑50ng/ml。利用本发明专利技术的无血清培养基，并将间充质干细胞在5％的低氧培养条件下进行。本发明专利技术的无血清培养基成分确定，质量可控，可用于组织贴壁分离间充质干细胞，可使间充质干细胞生长正常；无血清培养基配合低氧的培养条件，对间充质干细胞的生长具有协同促进作用，间充质干细胞生长情况大大改善，同时多次传代次后仍保持了间充质干细胞的“干性”及分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等类型细胞的能力。

A serum free medium and culture method for mesenchymal stem cells

The present invention discloses a serum-free medium and culture method of mesenchymal stem cells. The serum-free medium includes basic medium and added ingredients. The added component includes the hypoxia inducible factor 1, the concentration of the hypoxia inducible factor 1 is 10 20ng/ml, and the force growth factor, the force growth factor, is also included. The concentration is 20 50ng/ml. The serum free medium was used and the mesenchymal stem cells were cultured under 5% hypoxic culture conditions. The serum free medium composition of the present invention is determined and the quality is controllable, which can be used to organize MSCs to separate mesenchymal stem cells, and to make mesenchymal stem cells grow normally; the serum-free culture medium cooperates with hypoxia, and has synergistic effect on the growth of mesenchymal stem cells, and the growth of mesenchymal stem cells is greatly improved. At the same time, the ability of mesenchymal stem cells to differentiate into osteoblasts, chondrocytes and adipocytes was maintained after repeated passage.

【技术实现步骤摘要】
一种间充质干细胞无血清培养基及培养方法
本专利技术属于细胞培养领域，具体地说，涉及一种间充质干细胞无血清培养基及培养方法。
技术介绍
间充质干细胞(mesenchymalstemcell，MSC)，是一种具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞，来源于发育早期的中胚层和外胚层。间充质干细胞最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注；现已从肌肉、脂肪、牙周质、脐血、脐带等多种组织中分离得到。间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能。MSC已经在多方面被证明是自体和异体细胞移植、治疗的理想种子细胞。目前国内外已开展了多项MSC临床应用研究，涉及多种来源的MSC类型及多种疾病类型。从原代组织分离人脐带间充质干细胞都采用含血清培养基进行分离培养，特别是用于组织贴壁法获取间充质干细胞。血清中含有大量的氨基酸、核苷、蛋白质、激素、脂类等微量成分，可以让原代细胞轻易从组织中爬出，但血清中有些成分的含量和具体作用仍没有完全确定；且血清经常被病毒污染，还含有血小板生长因子等可能抑制细胞生长的物质。目前国内外对于间充质干细胞的扩增体系主要是基础培养基添加5-10％浓度的胎牛血清(FBS)。FBS中含有异种蛋白质，它本身有携带细菌、病毒、蛋白传染性疾病或朊病毒的风险。另外，有研究表明干细胞在培养过程中可以吞噬培养基中的蛋白，内含有牛血清蛋白(7mg-30mg/108个细胞)，可以使受者体内产生抗牛蛋白抗体，引起免疫反应，从而导致患者尤其在重复输注间充质干细胞治疗后治疗失效。现有的无血清培养基较难使干细胞从组织中爬出，难以进行细胞原代培养。因此，成分确定、质量可控且适合进行干细胞原代培养的无血清培养基是临床应用MSC培养的必然选择。有鉴于此特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种间充质干细胞无血清培养基及培养方法。本专利技术的无血清培养基成分确定，质量可控，可用于组织贴壁分离间充质干细胞，可使间充质干细胞生长正常；无血清培养基配合低氧的培养条件，对间充质干细胞的生长具有协同促进作用，间充质干细胞生长情况大大改善，同时多次传代次后仍保持了间充质干细胞的“干性”及分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等类型细胞的能力。为解决上述技术问题，本专利技术采用技术方案的基本构思是：本专利技术的第一目的是提供一种间充质干细胞无血清培养基，包括基础培养基和添加成分，所述的添加成分包括低氧诱导因子-1，所述的低氧诱导因子-1的浓度为10-20ng/ml。低氧诱导因子-1(hypoxia-induciblefactor，HIF)，也是低氧诱导结合蛋白，是细胞或组织在缺氧情况下产生的一种核转录因子。HIF能与人红细胞生成素基因结合增强其转录。HIF-1是HIF家族成员。HIF-1由一个120000的HIF-1α亚基和一个91000～94000的HIF-1β亚基组成，其广泛存在于哺乳动物和人体内。HIF-1α亚基和HIF-1β亚基同属basic-helix-loop-helix基因序列，是基本的螺旋环螺旋(basichelix-loop-helix-Per-ARNT-Sim，bHLH-PAS)转录因子超家族的一员。HIF-1普遍存在于人和哺乳动物细胞内，常氧下(氧气的体积分数为21％)也有表达，但合成的HIF-1蛋白很快就被细胞内氧依赖性泛素蛋白酶降解途径所降解，只有在缺氧条件下HIF-1才可稳定表达并能维持其活性。在缺氧状态下，HIF-1α亚基的降解被抑制，1α和β亚基形成有活性的HIF-1，转移到细胞核内调节多种基因的转录。HIF-1稳定表达时调节的靶基因有：促红细胞生成素(EPO)编码基因：血管内皮生长因子(VEGF)编码基因、胰岛素样生长因子Ⅱ编码基因、血小板源性生长因子(PDGF)、葡萄糖载体蛋白1、3(glucosetransporter-1、3，GLUT-1、3)和糖酵解酶，包括醛缩酶A(aldolaseA，ALDA)、烯醇化酶1(enolase1，ENO1)、乳酸脱氢酶A(1actatedehedrogenaseA，LDHA)、磷酸果糖激酶L(phosphofructokinaseL，PFKL)、磷酸甘油酸激酶1(phosphoglyceratekinase1，PGK1)、己糖基酶，2、3-磷酸甘油醛脱氢(glyceraldehydes-3-ph0sphatedehydrogenase，GAPDH)编码基因。HIF-1能够促使干细胞迁移，增殖，并能有效维护干细胞的分化能力。进一步的方案，所述的添加成分还包括力生长因子，所述的力生长因子的浓度为20-50ng/ml。力生长因子(mechanogrowthfactor，MGF)，是胰岛素样生长因子1(insulin-likegrowthfactor-1，IGF-1)的选择性剪接变异体，具有应力敏感性，MEG在细胞与组织中的作用是多样的。MGF能促间充质干细胞的增殖和迁移。MGF对成间充质干细胞的分化表现出不同程度的延迟作用，MGF能抑制间充质干细胞向成骨细胞分化，维持间充质干细胞处于未分化状态，MGF促增殖和抑制分化是通过下调关键转录因子来实现的。较优选的方案，低氧诱导因子-1与力生长因子的含量终浓度的比值为1：2-3；优选的，比值为1：2。经试验发现，当低氧诱导因子-1与力生长因子的含量终浓度比值在此范围内时，既能够提高细胞增殖速率，又能够维持间充质干细胞处于未分化状态，保证干细胞的分化能力。进一步的方案，所述的添加成分还包括CDLC、PDGF和促肾上腺皮质激素，CDLC的体积分数为1-5％，PDGF的浓度为10-20ng/ml，促肾上腺皮质激素的浓度为0.5-1ug/ml。CDLC(ChemicallyDefinedLipidConcentrate)，是化学成分确定的脂质浓缩物，是浓缩的脂质乳液，设计用于减少或替代细胞培养基中的胎牛血清，用于多种应用，包括CHO、杂交瘤和昆虫细胞培养物的生长和维持；通过杂交瘤产生单克隆抗体；以及在昆虫细胞中表达病毒。这种培养基添加剂的化学成分是确定的。PDGF是血小板衍生因子，是一种重要的促有丝分裂因子，具有刺激特定细胞群分裂增殖的能力。进一步的方案，所述的添加成分还包括以下成分，各成分的含量终浓度为：层粘连蛋白LN5211-4ug/mL、bFGF20-40ng/ml、EGF20-30ng/ml，VEGF20-40ng/ml、HGF20-40ng/ml、白血病抑制因子500-2000U/mL中的至少一种。碱性成纤维细胞生长因子(BasicFibroblastGrowthFactor，bFGF)是含155个氨基酸的促有丝分裂的阳离子多肽，分子量为16～18.5KD。bFGF具有广泛的生物学作用，对多种细胞的生长、分化及功能有影响，在正常生理和病理过程中发挥作用，其主要生物学作用有：(1)作为血管生长因子；(2)促进创伤愈合与组织修复；(3)促进组织再生；(4)参与神经再生等。bFGF有很强的肝素亲和力，在其114～123位氨基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加成分，所述的添加成分包括低氧诱导因子‑1，所述的低氧诱导因子‑1的浓度为10‑20ng/ml。

【技术特征摘要】
1.一种间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加成分，所述的添加成分包括低氧诱导因子-1，所述的低氧诱导因子-1的浓度为10-20ng/ml。2.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，所述的添加成分还包括力生长因子，所述的力生长因子的浓度为20-50ng/ml。3.根据权利要求1或2所述的一种间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，所述的添加成分还包括CDLC、PDGF和促肾上腺皮质激素，所述CDLC的体积分数为1-5％，PDGF的浓度为10-20ng/ml，促肾上腺皮质激素的浓度为0.5-1ug/ml。4.根据权利要求1-3任意一项所述的一种间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，所述的添加成分还包括以下成分，各成分及含量终浓度为：层粘连蛋白LN5211-4ug/mL、bFGF20-40ng/ml、EGF20-30ng/ml，VEGF20-40ng/ml、HGF20-40ng/ml、白血病抑制因子500-2000U/mL中的至少一种。5.根据权利要求1-4任意一项所述的一种间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，所述的添加成分还包括以下成分，各成分的含量终浓度为：转铁蛋白0.2-2ng/ml、胰蛋白酶10-30ug/ml、抑肽酶0.1mg/ml、胰岛素1-10U/ml、胆碱二柠檬酸盐20-30nM、磷脂酰胆碱1-10ng/ml、磷脂酸钠盐1-10ng/ml、大豆卵磷脂1-10ng/ml、维生素C50ug/ml、维生素E30ug/ml、维生素B1230ug/ml、雌二醇1-5ng/ml、睾酮1-5ng/ml、孕酮1-5ng/ml、地塞米松0.2-0.3nM、肝素50-200μg/mL、乙醇胺20-50nM、还原型谷胱甘肽2.5-5ug/ml、亚硒酸钠15-30nM、柠檬酸铁2.5-5ng/mL、L-...

【专利技术属性】
技术研发人员：施坤宁，刘惠，
申请(专利权)人：上海华新生物高技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31