本文公开了肉毒神经毒素(BoNT)多肽，所述多肽具有修饰的肉毒杆菌血清型B的受体结合结构域(B‑HC)，所述修饰的肉毒杆菌血清型B的受体结合结构域包含对应于血清型B，菌株1中的置换突变的一个或多个置换突变：V1118M、Y1183M、E1191M、E1191I、E1191Q、E1191T、S1199Y、S1199F、S1199L、S1201V、或它们的组合。特定的突变组合包括E1191M和S1199L、E1191M和S1199Y、E1191M和S1199F、E1191Q和S1199L、E1191Q和S1199Y、或E1191Q和S1199F。还公开了其它置换突变。还公开了分离的修饰的受体结合结构域、嵌合分子、药物组合物、以及使用它们的方法。
Engineered botulinum neurotoxin
This article discloses a polypeptide of botulinum neurotoxin (BoNT). The polypeptide has a receptor binding domain (B HC) of the modified botulinum serotype B. The receptor binding domain of the modified botulinum serotype B contains one or more permutation mutations corresponding to the serotype B, and the displacement mutation in strain 1: V1118M, Y1183M, E1. 191M, E1191I, E1191Q, E1191T, S1199Y, S1199F, S1199L, S1201V, or their combination. Specific mutation combinations include E1191M and S1199L, E1191M and S1199Y, E1191M and S1199F, E1191Q and S1199L, E1191Q and S1199Y, or E1191Q and E1191Q. Other permutation mutations have also been disclosed. Separate modified receptor binding domains, chimeric molecules, pharmaceutical compositions, and methods of using them are also disclosed.
【技术实现步骤摘要】
工程化的肉毒神经毒素本申请是申请日为2013年03月13日、专利技术名称为“工程化的肉毒神经毒素”的申请号为201380040738.4专利申请的分案申请。相关申请的交叉引用根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2012年5月30日提交的美国临时申请号61/653,214的优先权，以引用的方式将其整体内容并入本文。政府支持本专利技术是美国国立卫生研究院授予的NCRRRR000168的政府支持下完成的。美国政府对本专利技术享有一定的权利。
本专利技术涉及针对神经肌肉障碍(neuromusculardisorders)的治疗(therapeutics)的领域。
技术介绍
肉毒神经毒素(botulinumneurotoxin)是一个细菌毒素家族，包括七个主要血清型(BoNT/A-G)1。这些毒素通过阻断由神经元释放神经递质而发挥作用，从而使动物和人麻痹。近年来，BoNT已被广泛用于治疗越来越多的医学病症：局部注射微量毒素可以在目标区域削弱神经元活性(neuronalactivity)，这在许多医学病症中、以及对于美容目的而言可能是有益的2-4。BoNT/A和BoNT/B是仅有的两种目前经FDA批准用于人的BoNT2-4。这些是从细菌纯化而来、未经任何序列修饰(定义为野生型，WT)的毒素。随着BoNT的应用不断增加，已报道了多种限制和副作用。主要限制是在患者中产生中和抗体，这使得随后的治疗无效化5。终止使用BoNT往往使患者缺少其它有效的治疗/减轻其障碍的途径。抗体应答的可能性与毒素剂量和注射频率二者直接相关5。因此，这种限制主要发生在涉及相对高剂量毒素的肌肉痉挛治疗中。与此相一致的是，在使用非常低剂量毒素的美容应用中尚未观察到抗体应答5。主要的副作用也往往与治疗肌肉痉挛、而非美容应用相关。这是因为副作用主要是由毒素扩散至身体其它区域所致，并且毒素扩散的可能性与注射剂量直接相关。副作用的范围从短暂的非严重事件(如眼睑下垂和复视)直至危及生命的事件甚至死亡6，7。在由SidneyWolfe博士于2008年向FDA提交的请求书中，记载了共180例严重不良事件，其中16人死亡。因此，目前FDA要求在所有BoNT产品上标注“黑框警告”，强调毒素蔓延的风险，这一要求是在欧盟颁布了类似警告后作出的。由于中和抗体的产生和毒素扩散均与注射剂量直接相关，降低毒素剂量(同时保持相同水平的毒素活性)是高度期望的，这意味着必须增强单个毒素分子的效力。此类对于神经元具有改进的特异性的修饰BoNT也将减少任何潜在的由于非特异性进入其它细胞类型而致的脱靶效应。BoNT通过其受体结合结构域结合至其特异性受体，从而靶向并进入神经元，其受体结合结构域在文献中已有明确界定(BoNT-HC，图1A，图1B)1。受体结合决定BoNT识别神经元的效力和特异性。提高BoNT的受体结合能力将增强其对于目标神经元的效力和特异性。大多数BoNT的受体已经得以识别(图1C)。作为其受体，BoNT/B、D-C和G共享两个同源的突触小泡蛋白突触结合蛋白I和突触结合蛋白II(SytI/II)8-13，而BoNT/A、E、D和F使用另一个突触小泡蛋白SV29，14-18。除了蛋白受体以外，所有BoNT还需要脂质共受体(co-receptor)神经节苷脂(图1D)，其大量位于神经元表面19。在啮齿动物(以及可能地在大多数哺乳动物)中的两个Syt异形体(isoforms)中，SytII对BoNT/B的结合亲和力比SytI高～10倍，并且也是在运动神经末梢(BoNT的靶向神经元)中表达的主要异形体(图2A)20，21。因此，在啮齿动物(大多数研究均对其进行)中，认为SytII是运动神经末梢中的主要毒素受体，SytI则是次要毒素受体。可能存在争论的是，BoNT对神经元已具有很高特异性，是否有可能进一步改善其与神经元的结合？对人而言，答案是“是”，这是因为最近发现人SytII对于BoNT/B而言，作为受体的结合和功能均大大削弱，这是由于毒素结合位点中由啮齿动物(大鼠/小鼠)SytII发生了独特氨基酸改变13，22。这一改变是在第54位处(小鼠SytII序列)由苯丙氨酸(F)变为亮氨酸(L)(图2B)。序列比对已经揭示了，在整个脊椎动物(包括鸭嘴兽、鱼、啮齿动物和猴)间，该位置处的苯丙氨酸在SytI和SytII中均是高度保守的23。只有人和黑猩猩的SytII在这一位置含有亮氨酸。作为这一残基改变的结果，相比于小鼠SytII，人和黑猩猩的SytII与BoNT/B、D-C和G的结合大幅降低(图2C)，并且在介导BoNT/B进入方面效率明显较低(图2D)。由于人和黑猩猩的SytI在相同位置处仍然含有苯丙氨酸，并能结合BoNT/B、D-C和G(图2E)，人中的BoNT/B、D-C和G的高亲和力受体被限制为次要受体SytI。这些发现为以下临床观察提供了解释：为在患者中达到相同的疗效水平，与BoNT/A(结合不同受体)相比，需要剂量大得多的BoNT/B24，25。这些观察先前被归结于其它原因(如所使用的制剂中活性神经毒素的百分比)。BoNT/B与人SytII相对于BoNT/B与其它物种的SytII的此类结合差异的近期观察表明，BoNT/B的不同残基可能参与和人SytII的结合。因此，对BoNT/B进行的预期将影响与啮齿动物SytII的结合的序列修饰可能对于BoNT/B与人SytII的结合具有不可预知的影响。
技术实现思路
本专利技术的一个方面涉及一种肉毒神经毒素(BoNT)多肽，所述多肽包含蛋白酶结构域、蛋白酶切割位点、易位结构域(translocationdomain)和修饰的肉毒杆菌(Clostridialbotulinum)血清型B的受体结合结构域(B-HC)，所述修饰的肉毒杆菌血清型B的受体结合结构域包含对应于血清型B，菌株1(strain1)中的置换突变的一个或多个置换突变，所述置换突变选自于以下置换突变所组成的组：V1118M、Y1183M、E1191M、E1191I、E1191Q、E1191T、S1199Y、S1199F、S1199L、S1201V、以及以上置换突变的组合。在一个实施方式中，所述修饰的(B-HC)包含两个置换突变。在一个实施方式中，所述两个置换突变对应于E1191M和S1199L、E1191M和S1199Y、E1191M和S1199F、E1191Q和S1199L、E1191Q和S1199Y、或E1191Q和S1199F。在一个实施方式中，所述两个置换突变对应于E1191M和S1199L。在一个实施方式中，所述两个置换突变对应于E1191M和S1199Y。在一个实施方式中，所述两个置换突变对应于E1191M和S1199F。在一个实施方式中，所述两个置换突变对应于E1191Q和S1199L。在一个实施方式中，所述两个置换突变对应于E1191Q和S1199Y。在一个实施方式中，所述两个置换突变对应于E1191Q和S1199F。本专利技术的另一方面涉及一种肉毒神经毒素(BoNT)多肽，所述多肽包含蛋白酶结构域、蛋白酶切割位点、易位结构域和修饰的肉毒杆菌血清型B的受体结合结构域(B-HC)，所述修饰的肉毒杆菌血清型B的受体结合结构域在对应于血清型B，菌株1的S1199或S1201本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种肉毒神经毒素(BoNT)多肽，所述多肽包含：a)蛋白酶结构域；b)蛋白酶切割位点；c)易位结构域；以及d)修饰的肉毒杆菌血清型B的受体结合结构域(B‑HC)，所述修饰的肉毒杆菌血清型B的受体结合结构域包含对应于血清型B，菌株1中的置换突变的一个或多个置换突变，所述置换突变选自于以下置换突变所组成的组：V1118M、Y1183M、E1191M、E1191I、E1191Q、E1191T、S1199Y、S1199F、S1199L、S1201V、以及以上置换突变的组合。
【技术特征摘要】
2012.05.30 US 61/653,2141.一种肉毒神经毒素(BoNT)多肽，所述多肽包含：a)蛋白酶结构域；b)蛋白酶切割位点；c)易位结构域；以及d)修饰的肉毒杆菌血清型B的受体结合结构域(B-HC)，所述修饰的肉毒杆菌血清...
【专利技术属性】
技术研发人员：董民，彭立胜，波尔·埃里克·古斯塔夫·斯滕马克，罗尼·佩尔阿尔内·伯恩特森，
申请(专利权)人：哈佛大学校长及研究员协会，
类型：发明
国别省市：美国,US
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